방법 논문

마이 그 레이션의 인간 T 림프구 분리, 문화 및 분석 체외에서

DOI:

10.3791/2017

⸱

2010년 6월 1일

 , 
1Center for Vaccine Biology and Immunology, University of Rochester

이 논문에서

요약

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T 림프구 마이 그 레이션 림프 기관, vasculature에서 출구로 유도하는 동안 발생하고, 주변 조직을 체결. 여기, 우리는 T 림프구 마이 그 레이션을 분석하는 데 사용할 수있는 프로토콜을 설명 체외에서.

초록

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T lymphocytes의 마이 그 레이션은 다른 세포 또는 세포외 기질 단백질로 표현 리간드와 함께 세포 표면 integrins의 접착제 상호 작용을 포함한다. 낮은 친화 상태에서 세포 첨단에 높은 친화력 상태로 integrins의 정확한 spatiotemporal 활성화 T 림프구 마이 그 레이션에 대한 중요

프로토콜

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1. 인간의 T Lymphocytes의 분리

  1. 건강한 기증자로부터 인간의 혈액을 구합니다. 혈액은 다음 단계로 진행하기 전에 실내 온도 (~ 30 분)로 냉각 수 있습니다.
  2. 부드럽게 8 ML 왕복 하단의 폴리스티렌 튜브로 실내 온도 Polymorph 밀도 기울기 미디어 3 ML을 피펫. 부드럽게 Polymorph 미디어 위에 전체 혈액의 3 ML를 추가합니다. 두 시약의 혼합되지 않도록하는 것이 중요합니다.
  3. 실온에서 45 분간 500 XG에서 튜브를 원심 분리기.
  4. 원심 분리에 따라, 말초 혈액 mononuclear 세포 (PBMC)는 이제 최고 셀 레이어에 다른 혈액 구성 요소에서 분리합니다. PBMC 계층은 첫 번째 흐림 밴드로, 위에서 아래로 나타납니다.
  5. 조심스럽게 PBMC 레이어 위에 혈액의 맑은 노란색 상위 단계를 제거하고 15 ML 50 ML 원뿔 관에 PBMC 레이어를 전송하는 P1000 micropipette를 사용합니다.
  6. 오분 때마다 500 XG에서 세포를 centrifuging, PBS로 두 번 PBMC 씻으십시오. 뜨는은 각 씻고 나서 약간 뿌연됩니다.

2. 인간의 T Lymphocytes의 문화

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토론

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본 실험에서는, 우리는 기본 인간 T의 lymphocytes의 운동성를 분석하는 간단한 시스템에 대한 자세한 내용을 제공합니다. 체외 마이 그 레이션 assays 다양한 세포 유형의 운동에 관련된 다양한 분자와 신호 경로의 역할을 해부하다하는 데 사용되었습니다. 우리 프로토콜에서 자신의 실험을 설계할 때 염두에 두어야하는 몇 가지 중요한 컨트롤은 다음과 같습니다 : 1) 소 혈청 알부민 (BSA) 또는 폴리 - L 라이신 (PLL)과 같은 비 접착제 또는 비 인테 접착제 기판 코팅을, 각각 2 ) 인테 특정 등 SDF - 1의 프로토콜에서 설명한대로 stimulatory 신호 않고 인테 그린의 특이성, 그리고 3) 공동 코팅을 결정하는 항체 치료를 차단.

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공개 사항

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관심 없음 충돌 선언하지 않습니다.

감사의 글

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이 프로젝트는 국민 건강 기금 HL087088 (MK)의 연구소와 HL18208 (MK)에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
RPMI 1640GIBCO, Life Technologies11875
FBSThermo Fisher Scientific, Inc.SH300070.03
페니실린-스트렙토마이신GIBCO, 라이프 테크놀로지15140
1-스텝 다형체정확한 화학물질 & Scientific CorporationAN221725
PHARemel, Thermo Fisher ScientificR30852801
Rec. 인간 IL-2R& D 시스템202-IL
Rec. 인간 IL-15R& D 시스템247-IL
단백질 G시그마-알드리치19459
Rec. 인간 ICAM-1/FcR& D 시스템720-IC
Rec. 인간 SDF-1R& D 시스템350-NS
작성스

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Hyun, Y. M., Chung, H. L., McGrath, J. L., Waugh, R. E., Kim, M. Activated integrin VLA-4 localizes to the lamellipodia and mediates t cell migration on VCAM-1. J Immunol. 183, 359-369 (2009).
  2. Morin, N. A., Oakes, P. W., Hyun, Y. M., Lee, D., Chin, Y. E., King, M. R., Springer, T. A., Shimaoka, M., Tang, J. X., Reichner, J. S., Kim, M.

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