Photomotor Response Assay: 조명 조건의 급격한 변화에 대한 애벌레 제브라피시의 행동 반응을 측정하는 방법

1. 비디오 추적 매개 변수 보정

1. 동작 측정을 수행하기 전에 비디오 트랙 소프트웨어에서 관찰 및 보정 매개변수를 설정합니다(재료 표 참조).
   1. 개별 우물에 최소 1마리의 애벌레 물고기가 있는 기록 챔버에 우물 플레이트를 놓습니다. 플레이트 및 관련 물고기를 표현으로 사용하여 보정 매개변수를 설정합니다.
   2. 비디오 트랙 소프트웨어에서 "파일 | Generate Protocol"을 클릭하면 "프로토콜 생성 마법사" 대화 상자가 열립니다. "Location Count(위치 수)" 필드에 웰 플레이트의 개별 웰 수를 입력한 다음 "OK(확인)"를 클릭합니다.
   3. 화면 상단에서 "보기 | Full Screen(전체 화면)"이 표시되면 시스템에 웰 플레이트의 오버헤드 카메라 보기를 표시하라는 메시지가 표시됩니다.
   4. 세 가지 다색 모양으로 나타나는 "그리기 영역" 아이콘을 클릭합니다. 웰 플레이트 보기 영역의 오른쪽에 있는 "Areas(영역)"라고 표시된 필드에서 원 아이콘을 선택합니다.
   5. 커서를 사용하여 웰 플레이트의 왼쪽 상단 웰에 있는 원형 비디오 추적 영역을 표시합니다. "오른쪽 상단 표시"를 선택한 다음 오른쪽 상단 우물의 보기 영역을 윤곽을 그립니다. 그런 다음 "하단 표시"를 선택하여 오른쪽 하단 우물의 윤곽을 그립니다.
      참고: 원형 윤곽선을 그린 후에는 위치를 조정해야 할 수 있습니다. 윤곽선의 위치를 조정하려면 "선택"을 클릭한 다음 커서를 사용하여 윤곽선 영역을 이동합니다. 또한 윤곽선은 "복사"를 클릭한 다음 "붙여넣기"를 클릭하여 복제할 수 있습니다.
   6. 왼쪽 상단, 오른쪽 상단 및 오른쪽 하단 웰 추적 영역을 정의한 후 "Build(구축)"를 클릭하여 소프트웨어가 나머지 웰의 보기 영역을 자동으로 표시하도록 요청합니다.
   7. "Calibration"이라고 표시된 영역에서 "Draw Scale"을 클릭합니다. 커서를 사용하여 플레이트를 가로질러 수평선을 그립니다. 선이 그려지면 "Calibration measurement"라고 표시된 대화 상자가 나타납니다. 웰 플레이트 길이를 입력하고 "확인"을 클릭합니다.
   8. "Draw Areas" 아이콘을 클릭하여 도면 관리자를 종료합니다.
   9. "타일" 아이콘을 클릭합니다. 커서를 사용하여 보기 화면에 나타나는 모든 상자를 강조 표시하여 각 상자가 녹색이 되도록 합니다.
      참고: 타일 아이콘은 6개의 개별 작은 사각형 그룹으로 나타납니다
   10. "보기를 클릭하십시오| 전체 화면". 플레이트 보기 영역의 오른쪽에 있는 "Detection Threshold"라고 표시된 상자에서 "Bkg"를 클릭합니다. 임계값 조정 막대를 사용하여 픽셀 감지 임계값을 설정합니다. 적절한 픽셀 감지 임계값을 선택했으면 "Apply to Group"을 클릭합니다.
       참고: 이 프로토콜은 제브라피시 관찰의 경우 블랙 모드에서 13으로, 팻헤드 미노우 관찰의 경우 투명 모드에서 110으로 감지 임계값을 설정합니다.
   11. "Movement Threshold"라고 표시된 상자에 원하는 이동 속도 추적 매개변수를 입력합니다. 속도 매개변수가 설정되면 "그룹에 적용"을 클릭합니다.
       참고: 이 프로토콜은 작은/큰 움직임을 20mm/s로, 비활성/작은 움직임을 5mm/s로 설정합니다. 이러한 선택은 비활성(동결) = <5mm>20mm/s의 세 가지 속도 수준에서 유충 물고기의 움직임을 추적하도록 소프트웨어를 프로그래밍합니다.
   12. "Parameters(매개변수) | Protocol Parameters(프로토콜 매개변수)"를 선택합니다. 대화 상자에서 "시간" 탭을 선택합니다. 관측 시간과 적분 시간을 입력합니다. 매개변수를 입력한 후 "확인"을 클릭합니다.
   13. 각 광주기에 대한 명/암 광주기 시간 및 광 강도를 설정하려면 "매개변수" 드롭다운 메뉴에서 "라이트 드라이빙"을 선택하여 라이트 드라이버 설정 대화 상자를 엽니다.
       참고: 여러 명암 광주기 설정에 대해서는 프로토콜 비디오를 참조하십시오.
   14. 비디오 추적 매개 변수를 설정한 후 관찰 프로토콜을 저장합니다.
       참고: 이 프로토콜은 10분의 적응 단계와 2개의 10분 밝기 기간과 2개의 10분 어둠 기간으로 구성된 4개의 변화하는 밝음/어두운 단계를 포함하여 50분 동안 물고기의 행동을 관찰합니다. 통합 시간은 50분 행동 시험의 각 분에 대한 행동을 측정하도록 설정됩니다.

2. 유충 물고기의 운동 운동 및 광운동 행동 관찰

1. 실험용 물고기가 들어 있는 우물 접시를 행동 기록 챔버에 놓습니다.
2. 비디오 추적 소프트웨어에서 다음 단계에서 개발된 추적 프로토콜을 엽니다.
3. 비디오 추적 뷰어에서 모든 유충이 컴퓨터 화면에 보이는지, 각 우물에 하나의 개별 유충만 있는지, 개별 유충이 1.1.5 및 1.1.6단계에서 정의된 관찰 영역 내에 정렬되어 있는지 확인합니다.
4. "실험 | ".
   실행합니다. 참고: 시스템은 사용자에게 관찰 데이터를 저장할 이름과 위치를 제공하라는 메시지를 표시합니다.
5. 관측 데이터의 이름과 저장 위치가 지정되면 "Multiple Live Images(여러 라이브 이미지)" 아이콘을 클릭하여 사전 정의된 모든 보기 영역을 강조 표시합니다
   참고: 이 아이콘은 컴퓨터 화면 상단에 있으며 4개의 작은 사각형으로 나뉘어진 상자로 나타납니다. 이 아이콘을 클릭하면 미리 정의된 모든 보기 영역이 강조 표시됩니다.
6. 녹음실의 패널을 닫고 "배경 | 컴퓨터 모니터에서 시작"을 누릅니다.