먹이 포획 분석: 제브라피시 유충의 피식자 포획 행동을 연구하는 방법

초록

출처: Muto, A., et al. 이광자 레이저를 사용한 뉴런 집단의 절제 및 제브라피시 유충의 칼슘 이미징 및 행동 기록을 사용한 평가. J. Vis. 특급(2018년)

이 비디오는 먹이 포획 분석에 대해 설명합니다. 이 비디오는 특정 뉴런의 레이저 절제 후 제브라피시 유충의 먹이 포획 행동을 연구하는 방법에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 레이저 절제 후 행동 결과 평가

1. 비디오 카메라가 장착된 스테레오스코프로 구성된 행동 기록 시스템을 설정합니다. 적절한 이미지 획득 소프트웨어(상용 또는 맞춤형)가 있는 카메라를 사용하십시오(그림 1A).
2. 이미지 처리로 paramecium을 감지할 수 있도록 조명 조건을 최적화합니다. 예를 들어, 스페이서가 있는 링 백색 LED 조명을 사용합니다(그림 1B).
   참고: LED로부터의 거리와 LED의 각도는 샘플의 모양(즉, 어두운 배경에서는 밝거나 밝은 배경은 어둡음)에 영향을 미치므로 성공적인 이미지 처리에 매우 중요합니다. 스페이서의 최적 높이를 결정합니다(그림 1C).
3. 제브라피시 유충(섹션 1에 설명된 레이저 절제 실험에서 회수됨)을 원래 상단 씰을 제거한 상태로 행동 기록 챔버(유리 슬라이드에 부착됨)에 놓습니다(그림 1D).
4. 마이크로피펫을 사용하여 비커에서 물에 떠 있는 파라메시아 50개를 모아 기록실에 넣습니다.
5. 녹음실 위에 커버 슬립을 놓습니다. 챔버에 공기가 유입되지 않도록 기록 챔버의 물 표면에 놓기 전에 커버 슬립에 물 한 방울을 떨어뜨립니다.
   참고: 이 단계에서는 파라메시아가 있는 일부 물이 녹음실에서 넘칠 수 있습니다. 기록 챔버에 남아 있는 파라메시아의 수는 대략 30-40개일 것이다.
6. 기록 챔버(유충 및 파라메시아 포함)를 조명 시스템에 배치합니다(그림 1D).
7. 10fps로 11분(6,600프레임) 동안 타임랩스 녹화를 시작합니다.
8. (선택 사항) 행동을 테스트한 각 유충에 대해 형광 현미경으로 레이저 절제 영역의 형광을 관찰하여 레이저 절제의 효과(즉, 레이저 조사 영역에서 형광 세포의 부재 또는 현저히 감소)를 확인합니다.
   참고: 방사선 조사 후에도 일부 형광 세포는 절제 후 분화된 세포에서 Gal4 유전자 발현이 나중에 시작되기 때문에 여전히 관찰될 수 있습니다.
9. 유충의 행동을 기록한 후, 배경의 불균일성을 보완하기 위해 피지에서 각 프레임을 평균 이미지로 픽셀 단위로 나누기를 수행합니다: 'Process', 'Image Calculator', 'Operation: Divide', '32-bit(float)result', 'OK'를 클릭합니다. 평균적인 이미지를 만들려면 '이미지', '스택', 'Z-프로젝트', '평균 강도' 및 '확인'을 클릭합니다(그림 1E, F).
10. 'Analyze(분석)', 'Analyze Particles(입자 분석)'를 클릭하고, 모든 paramecia를 포함하는 영역 범위를 설정하고, 'Show:Masks' 확인란을 선택한 후 'OK(확인)'를 클릭하여 챔버에 남아 있는 paramecia의 수를 계산합니다. 'Show:Masks' 옵션은 각 프레임의 입자(paramecia) 수와 함께 추출된 paramecia 이미지(그림 1G)를 제공합니다.
11. 시간 경과에 따라 기록실에 남아 있는 파라메시아의 수를 플로팅합니다. paramecia 수의 추정치에 노이즈가 있기 때문에 스프레드시트에서 600프레임(1분) 범위의 각 포인트에 대해 이동 평균을 수행하는 것이 좋습니다.

결과

그림 1. 먹이 포획 분석 및 레이저 절제 제브라피시 유충의 대표 데이터.(A) 행동 기록 시스템. 실체 현미경에는 CMOS 카메라가 장착되었습니다. 이미지는 맞춤 제작된 스크립트를 사용하여 획득했습니다. (B) 조명 시스템의 구성 요소. 회색 종이, 유리 디퓨저, 흰색 LED 링 라이트, 디퓨저, 맞춤형 스페이서(판지), 중앙에 구멍이 뚫린 디퓨저. (C) B. (D) 먹이 포획 분석을 위한 기록 챔버에 표시된 부품으로 조립된 조명 시스템. 챔버(직경: 20mm, 깊이: 2.5mm)를 유리 슬라이드에 놓았습니다. 챔버의 원래 상단 씰이 벗겨졌습니다. 녹음실에는 유리 덮개가 씌워졌습니다. (E) 녹화된 동영...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
이미징 챔버	그레이스 바이오 랩스	CoverWell 이미징 챔버 PCIA-2.5	행동 기록 챔버로 사용
ORCA-플래시4.0	하마마츠 포토닉스	모델:C11440-22CU	과학용 CMOS 카메라
SZX7	올림푸스		입체경
링 LED 조명	증권 시세	모델: LDR2-100SW2-LA	백색 LED
Secure-Seal 하이브리드화 챔버 개스킷, 챔버 8개, 직경 9mm x 깊이 0.8mm	분자 프로브	카탈로그 # S-24732	Ca 이미징에서 기록 챔버로 사용