탈출 반응 분석: 접촉 자극에 대한 제브라피시 유충의 반응을 연구하는 방법

초록

출처: Sztal, T. E., et al. 터치 유발 반응 및 운동 분석을 사용하여 제브라피시의 근육 성능 및 기능을 평가합니다. J. Vis. 특급.(2016년)

이 비디오는 터치 자극에 대한 제브라피시 유충의 반응을 측정하는 터치 유발 반응 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 터치 유발 반응 분석

1. Touch-evoked Response Assay를 위한 2개의 dpf 배아 준비
   1. 하루 종일 활동이 크게 달라질 수 있으므로 실험 간에 테스트가 수행되는 시간이 일정한지 확인하십시오.
      참고: 실험은 맹검 방식으로 수행되어야 하며 실험 아티팩트를 최소화하기 위해 테스트 순서가 무작위화되어야 합니다.
   2. 물고기 균주에 실험을 수행하는 개인이 알 수 없는 숫자를 할당합니다. 그런 다음 무료로 사용할 수 있는 온라인 도구를 사용하여 테스트 순서를 지시하는 무작위 목록을 생성합니다.
   3. 실험 최소 1시간 전에 융모막에 구멍을 뚫고 가는 핀셋을 사용하여 융모막을 부드럽게 당겨 배아를 분리한다. 28°C 인큐베이터로 돌아가기 전에 페트리 접시에서 이물질을 제거하십시오.
2. Touch-evoked Response Assay 수행
   1. 테스트를 시작하기 최소 15분 전에 스테이지를 28°C로 가열합니다.
      알림: 이 stage는 온도가 제어되며 테스트 기간 동안 28°C로 유지됩니다. 온도는 활동에 영향을 미치므로 일정한 온도를 유지하는 것이 중요합니다. 가열된 스테이지를 사용할 수 없는 경우 물의 온도를 모니터링하고 모든 실험을 동일한 온도에서 수행해야 합니다.
   2. 배아 배지(물 속의 5 mM NaCl, 0.17mM KCl, 0.33 mM CaCl₂, 0.33 mM MgSO₄)로 채워진 페트리 접시를 조명이 켜진 무대에 놓고 페트리 접시 위에 고속 카메라를 장착합니다.
   3. 비디오 카메라 녹화 소프트웨어(예: 여기에 설명된 Stream Pix 5)를 실행하고 "작업 공간" 탭에서 캡처 속도로 초당 1,000프레임(1,000fps)을 선택하여 물고기의 빠른 수영 동작을 기록합니다.
   4. 한 번에 하나의 배아로 작업하면서 제브라피쉬가 시야에서 명확하게 보이는 페트리 접시 중앙에 배아를 놓습니다.
      참고: 배아가 실험 시작 전에 헤엄쳐 떠나는 경우, 배아를 다시 포획하고 위치를 잡으면 자극에 둔감해질 수 있으며 반복적인 폭발 반응으로 인해 일부 질병 모델에서 근육 약화가 촉진될 수 있으므로 다른 배아로 교체하십시오.
   5. "녹음" 버튼을 클릭하여 기록을 시작하고, 머리 꼭대기에 있는 뭉툭한 바늘로 배아를 부드럽게 터치하여 배아에 기계감각 자극을 전달합니다.
   6. 배아가 시야 밖으로 헤엄쳐 나오거나 휴식으로 돌아온 후 기록을 중지합니다.
      참고: 가속은 기계적 자극에 따른 버스트 탈출 응답의 처음 0.2초 이내에 최고조에 달합니다. 따라서 탈출 응답을 기록하는 처음 0.2초 동안 물고기가 시야에 있는지 확인하십시오. Stream Pix 5 소프트웨어를 사용하면 데이터가 자동으로 .avi 비디오 파일로 저장됩니다. Free Video Capture 또는 Softonic과 같은 대체 비디오 캡처 소프트웨어도 무료로 다운로드할 수 있으며 사용할 수도 있습니다.
   7. 배아를 새 페트리 접시에 다시 넣고 테스트를 위해 다른 배아를 선택합니다. 최소 15마리의 물고기에 대해 테스트를 수행합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
90mm 페트리 접시	태평양 실험실 제품	태평양 표준시 S90001
핀셋, 스타일 8	프로사이테크	T04-821
부 화기	Thermoline 사이언티픽	TEI-43L
고속 카메라	바우머	HXC20
스트림픽스5	노픽스		단계 1.2.3
온도 제어 장치	관점
http://www.randomization.com	해당 사항 없음		단계 1.1.2