배아 기반 화학 독성 스크리닝: 제브라피시 배아 발달에 미치는 영향 평가

초록

출처: Hao J. et al., 대형 제브라피시 기반 생체 내 소분자 스크린. J. Vis. 특급 (2010년)

이 기사에서는 제브라피시 배아가 화학적 독성 검사에 사용됩니다. 화학적 독성은 표현형 판독과 상관관계가 있습니다. 샘플 프로토콜은 화학적 독성 스크리닝을 수행하는 방법론적 접근 방식을 보여줍니다.

프로토콜

1. Small Molecule Library 전송

로봇 전달 방법으로 복합 전달을 자동화할 수 있지만 수동 전달 방법에 대해 설명합니다.

1. 소분자 라이브러리는 일반적으로 96웰 형식으로 제공되며 각 화합물은 DMSO에 10mM 스톡으로 저장됩니다. 배아가 화합물을 첨가할 단계에 도달하기 약 60분 전에 소분자의 분취량(source plate)을 포함하는 원하는 수의 96-well plate를 해동합니다. 소스 플레이트의 일련 번호 또는 기타 식별 번호를 기록해 두십시오. 플레이트의 응축을 최소화하기 위해 Drierite(W.A. HAMMOND DRIERITE CO, Xenia, OH)를 포함하는 건조 챔버에서 해동이 발생할 수 있습니다.
2. 멀티웰 플레이트 어댑터가 장착된 탁상용 원심분리기에서 플레이트를 잠시 회전시킵니다.
3. 소스 플레이트에서 알루미늄 밀봉 테이프를 제거합니다. 12채널 피펫을 사용하여 소스 플레이트의 화합물을 0.5mM 농도로 희석합니다(예: 10mM 스톡의 250nL 분취액으로 시작하는 경우 각 웰에 4.75μL의 DMSO를 추가합니다).
4. 96웰 플레이트(수용 플레이트)의 배아가 원하는 단계에 도달하면 12채널(2-20μL) 피펫을 사용하여 소스 플레이트에서 2.5μL의 화합물(0.5mM)을 배아가 포함된 수용 플레이트로 전달합니다.
5. 수혜자 배아 플레이트에 있는 소스 플레이트의 식별 번호를 기록합니다. 현재 배아와 화합물이 들어 있는 수용 플레이트를 뚜껑으로 덮고 부드럽게 소용돌이치면서 플레이트를 부드럽게 혼합한 다음 28.5°C 인큐베이터에 넣습니다.
6. 사용하지 않은 소분자(0.5mM)가 포함된 각 소스 플레이트를 알루미늄 밀봉 테이프로 덮고 장기 보관을 위해 -80°C 냉동고에 넣습니다.

2. 표현형의 육안 검사를 통한 소분자의 영향 스크리닝

1. 스크린을 수행하기 전에 "히트"를 구성하는 것에 대한 구체적인 기준을 공식화하십시오.
2. 원하는 발달 시기에 인큐베이터에서 화합물 처리된 배아가 포함된 96웰 플레이트를 제거하고 실체현미경으로 각 웰을 검사합니다. 순환 패턴의 변화와 같은 미묘한 변화를 더 잘 시각화하기 위해 위상차 도립 현미경을 사용할 수 있습니다. 형광 현미경 검사는 조직 특이적 프로모터 아래에서 GFP 또는 DsRed 단백질의 발현 섭동을 검사하는 데 사용할 수 있습니다.
3. 96웰 플레이트를 빠르게 스캔하여 5개의 배아 중 최소 3개가 규정된 "히트" 표현형을 나타내는 웰이 있는지 확인합니다. 플레이트의 정체와 각 잠재적 타격의 웰 위치를 기록합니다.
4. 여러 용량(1uM, 5uM, 10μM 및 50μM)에서 화합물의 효과를 재테스트하여 잠재적인 히트를 재확인합니다. 각 용량에 대해 10개의 배아를 48웰 플레이트 형식의 0.5mL E3 배지에서 테스트합니다. 재검사를 위한 화합물 첨가 시기는 원래 스크리닝과 동일해야 합니다. 유도된 표현형이 화합물의 재검사에서 재현될 때 히트가 확인됩니다.
5. chemical library에 있는 small molecules의 데이터베이스에서 hit 화합물을 식별합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMSO에서 10mM 스톡에서 96-wll 형식으로 배열된 구조적으로 다양한 화합물의 소분자 라이브러리. 각 마스터 플레이트는 96웰 폴리프로필렌 저장 플레이트(Corning)에 분주되어 -80°C에서 까지 보관됩니다. 쓰다.
드라이라이트	W.A. HAMMOND DRIERITE CO, 오하이오주 제니아
12채널 피펫, 2-20 μL	에펜도르프
96웰 플레이트용 알루미늄 밀봉 테이프	Nunc, 로체스터, 뉴욕
디엠소	시그마, 세인트루이스, 미주리
기본 인큐베이터, 28.5°C	피셔 사이언티픽
폴리스티렌 96웰 둥근 바닥 분석 플레이트	코닝 코스타; 로웰, 매사추세츠
투과광 베이스가 있는 실체현미경	라이카 마이크로시스템즈, 일리노이주 배넉번
E3 배아 배지: 5 mM NaCl, 0.17 mM KCl, 0.33 mM CaCl2 , 0.33 mM MgSO4 , 0.003% PTU (페닐티오카르바미드, 시그마; 세인트루이스, 미주리주) 함유.			PTU는 1L의 E3 배아 배지에 0.3g PTU를 용해하여 10x 용액으로 준비할 수 있습니다. PTU가 포함된 용액은 알루미늄 호일로 덮어 빛으로부터 보호해야 합니다.