표적 간 절제술: 형질전환 제브라피시 유충에서 메트로니다졸을 사용한 간세포 사멸 유도

초록

출처: Choi T.Y., et al. 담즙 주도 간 재생을 연구하기 위한 제브라피쉬의 간세포 특이적 절제술. J. Vis. 특급 (2015년)

이 기사는 형질전환 제브라피시 유충에서 메트로니다졸로 간세포 사멸을 유도하는 방법인 표적 간 절제술에 대해 설명합니다. 샘플 프로토콜은 제브라피시에서 표적 간 절제를 생성, 조작 및 평가하는 프로세스를 설명합니다.

프로토콜

1. 배아/유충의 준비

1. 배아 100개를 달걀수 25ml와 함께 100mm 페트리 접시에 옮깁니다. 페트리 접시당 100개 이상의 배아를 보관하지 말고 28°C에서 키웁니다.
2. 색소 침착을 억제하려면 수정 후 10시간(hpf) 전에 페트리 접시에 페닐티오우레아(PTU)를 추가하고 배아/유충을 80hpf까지 키웁니다. PTU의 최종 농도는 0.2mM.
   입니다. 주의: PTU는 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침에 따라 사용하십시오.
3. 페트리 접시에 최종 농도 0.016%의 3-아미노 벤조산 에틸 에스테르(Tricaine)를 첨가하여 유충을 마취합니다. 그런 다음 epifluorescence microscope를 사용하여 CFP 양성 유충을 분류합니다. 간 크기가 비슷한 유충을 사용하고 간이 작거나 큰 유충은 버립니다.
   참고: 반접합 유충과 동형접합 유충 사이의 간세포 절제 정도에는 차이가 없기 때문에 강도에 관계없이 모든 CFP 양성 유충을 사용할 수 있습니다.
   주의: 트리카인은 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침에 따라 사용하십시오.
4. 트리카인이 함유된 달걀 물을 제거하고 0.2mM PTU가 보충된 달걀 물을 추가합니다. 배아/유충을 28°C로 유지하십시오.

2. Mtz 트리트먼트

1. 0.2% DMSO 및 0.2mM PTU가 보충된 100ml 달걀수에 0.171g의 Mtz 분말을 용해하여 신선한 10mM Mtz 용액을 준비합니다. Mtz를 완전히 용해시키려면 RT에서 용액을 20-30 분 동안 빠르게 교반하면서 혼합하십시오. Mtz를 용해시키고 유충으로의 Mtz 투과를 향상시키기 위해 Mtz.
   를 준비할 때 DMSO를 추가합니다. 주의: Mtz에 장기간 노출되거나 농도가 증가하면 독성이 있습니다. 적절한 취급 지침에 따라 사용하십시오.
2. 원하는 수의 유충을 두 개의 서로 다른 100mm 페트리 접시 또는 멀티웰 플레이트로 옮겨 유충을 대조군과 실험군으로 분리합니다. 실험 그룹의 경우 유충을 10mM Mtz 용액에 보관하십시오. 대조군의 경우 0.2% DMSO가 함유된 달걀 물에 보관하십시오.
3. Mtz 용액이 들어있는 접시 또는 페트리 접시를 알루미늄 호일로 덮어 Mtz의 광비활성화를 방지하고 28 ° C에서 배양합니다. Mtz 처리 기간은 유충 단계와 형질전환 계통에 따라 다릅니다.

3. 담즙에 의한 간 재생 분석

1. 절제 기간이 끝나면 플레이트에서 Mtz 용액을 제거합니다. Mtz 처리된 유충은 달걀 물 25ml를 넣어 씻습니다. 접시를 2-3회 휘둘러 유충을 씻은 후 달걀 물을 버립니다. 세 번 반복한 다음 유충을 달걀 물에 한 번 더 담그십시오. Mtz 처리된 유충에서 심장 부종과 유충 사멸을 방지하려면 최종 농도 0.008%에서 더 낮은 농도의 트리카인을 첨가하여 유충을 고정시킵니다.
2. 간 분석을 위해 CFP 필터를 사용하여 상피 형광 현미경으로 Mtz 처리된 유충의 간 크기를 검사합니다. 상대적인 간 크기에 따라 간세포 절제 수준을 평가합니다: 큰 유모(절제되지 않은 유충, 0-10% 유충), 중간 크기(부분적으로 절제된 유충, 10-20%), 매우 작은 유충(완전히 절제된 유충, 80-90%).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
3-아미노 벤조산 에틸 에스테르(트리카인) 분말	시그마-알드리치	A5040	0.4%(15mM) 트리카인 육수 만들기 : 트리카인 0.4g을 달걀 물과 함께 100mL에 넣습니다. pH 7로 조정합니다.
디메틸설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	D8418
메트로니다졸	시그마-알드리치	M1547
N-페닐티오우레아(PTU)	시그마-알드리치	P7629
100 x 15mm 페트리 접시	덴빌 사이언티픽 Inc.	M5300
달걀 물			0.3g/L의 바다 소금 'Instant Ocean' 및 0.5mM CaSO4를 증류수에 함유
epifluorescence microscope (에피 형광 현미경	라이카 마이크로시스템즈	M205FA

(영문) . ) 시리즈