Morpholino 주입: 제브라피쉬의 기능을 연구하기 위해 표적 유전자 발현을 knockdown하는 방법

Abstract

출처: Hyde D.R., et al. 재생 성인 제브라피시 꼬리 지느러미로 Morpholinos의 생체 내 전기천공법. J. Vis. 특급 (2012년)

이 프로토콜은 꼬리에 모르폴리노 주입에 의한 제브라피쉬의 유전자 발현의 표적 녹다운을 설명합니다.

Protocol

1. 모르폴리노 주입

1. 모르폴리노를 주입하기 전날 주입 플레이트를 만듭니다(그림 1). 우물의 한쪽 끝에 있는 노치를 잘라내면 미세 주입 절차를 위해 물고기를 안정시키는 데 도움이 됩니다.
2. 플루오레세인 태그가 붙은 모르폴리노를 적절한 농도(1.2mM부터 시작하는 것이 좋음)로 희석하고 65°C 수조에 5분 동안 넣습니다.
3. 모르폴리노로 바늘을 로드합니다(참고: 바늘을 다시 채우는지 앞을 넣는지에 따라 바늘을 먼저 넣을지 아니면 팁을 먼저 자르는지가 결정됩니다).
4. 바늘 끝을 비스듬히 자릅니다.
5. 마이크로 주입 시스템의 지시에 따라 주입 당 약 5nl의 morpholino 거품을 주입하십시오. 모르폴리노의 양이 많으면 조직이 파괴될 수 있습니다.
6. 물고기를 마취하고 주입 플레이트에 놓습니다. 여분의 액체를 모두 제거하고 바늘을 뼈 광선의 원위부에 있는 적절한 위치로 향하게 합니다(그림 2). 모르폴리노 주입에 적합한 현미경 및 미세주입 장치(특정 시약 표 참조)를 사용하여 그림 2와 같이 모르폴리노를 전방에서 후방으로 핀에 주입합니다. 후방에서 전방으로 주입하면 주입 중에 지느러미 조직이 말려 올라가 매우 어렵습니다.
7. 바늘을 각 뼈 광선의 원위부(그림 2에서 "1"로 표시)의 원위부에 삽입하고 포반(그림 2에서 "2"로 표시)에 위치할 때까지 원위부로 밀어 넣습니다. 바늘을 핀 전체에 밀어 넣지 않도록 주의하십시오. 바늘이 올바르게 국소화되면 모르폴리노를 주입합니다(즉, 한 번 클릭). 1.2mM에서 플루오레세인 태그가 붙은 모르폴리노 용액은 정상적인 조명 조건에서도 황록색으로 나타납니다. 주사할 때마다 모르폴리노 용액의 노란색 "퍼프"를 시각화할 수 있으며, 이는 주사를 모세포에 국한시키는 데 도움이 됩니다. 뼈선당 약 75nl(10-15클릭)의 모르폴리노 용액을 주입해야 합니다. 클릭 사이에 ~ 1초를 일시 중지합니다. 우리는 배쪽을 전기천공법으로만 조절하는 것으로 사용하여 등쪽에만 주입합니다.

Results

그림 1. A. 아가로스로 만들어졌으며 모르폴리노의 미세주입 중에 물고기를 담을 수 있는 작은 우물이 포함된 주입판의 개략도.

그림 2. morpholino 미세주입의 도식. A. 물고기의 머리를 우물에서 잘라낸 노치에 넣어 접시에 넣으면 물고기가 안정적으로 유지될 수 있습니다. B. 저배율에서는 바늘을 지느러미의 재생 조직에 가깝게 배열합니다. C. 더 높은 배율에서는 각 뼈 지느러미 광선에 원위부에 Morpholino를 주입합니다(즉, 각 ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
모르폴리노	진툴즈, LLC		Morpholino는 관심 단백질에 맞게 맞춤 설계되어야 합니다.
마이크로 분사 펌프	월드 정밀 기기, Inc.	PV830	공압 PicoPump 다양한 미세분사 시스템을 사용할 수 있습니다.
마이크로 매니퓰레이터	월드 정밀 기기, Inc.	음주니어	오른손잡이 (왼손잡이는 MMJL)
마이크로 주사 바늘, 외경 1.0mm	월드 정밀 기기, Inc.	AN-번호 1B100F-4	이것은 바늘로 당겨진 붕규산 유리 모세관입니다
바늘 홀더	월드 정밀 기기, Inc.	5430- 모두	Pico 노즐 키트, 1.0mm 피펫 개스킷을 삽입해야 합니다.
니들 풀러	셔터 인스트루먼트 컴퍼니	P-97	다른 마이크로피펫/바늘 풀러도 작동해야 합니다
현미경	라이카, 니콘, 자이스	번호는 제조업체에 따라 다릅니다.	20X 광학 장치와 마이크로 매니퓰레이터로 작업할 수 있는 모든 실체 현미경
2-페녹시에탄올	시그마-알드리치	77861-1L	마취; 절차를 위해 어류 시스템 물에 1:1000, 안락사를 위해 1:500을 희석