짝짓기와 난자 발굴: 배아를 생성하고 발달 단계별로 분류하는 방법

Abstract

출처: Hostelley T.L., et al. 제브라피쉬의 RNASeq 기반 유전자 발현 데이터의 샘플 준비 및 분석. J. Vis. 특급 (2017년)

이 기사는 자연스러운 짝짓기와 발달 단계 분류를 통해 제브라피시 배아를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 형질전환 어류를 사용하여 췌장 β세포를 분석하는 데 추가로 사용됩니다.

Protocol

1. 자연교배를 통한 배아 생성

1. 생후 3개월까지의 배아 배아, 생식 성숙.
2. 배아 채취 전날 저녁에 원하는 균주에서 성체 수컷과 암컷 물고기를 분할된 짝짓기 탱크로 분리하고 각 탱크에 수컷 2마리와 암컷 3마리를 추가합니다.
   참고: 형질전환 인슐린2a:mCherry 형광 리포터 균주를 사용하여 췌장 β세포를 분석할 수 있었습니다.
3. 신선한 시스템 물이 담긴 결합 탱크로 물고기를 옮기고 다음 날 아침 불이 켜진 직후 분배기를 제거하십시오.
4. 바닥 수조에서 배아가 관찰될 때까지 물고기가 자연스럽게 짝짓기를 하도록 합니다. 원하는 양이 수집될 때까지 30분 간격으로 배아를 수집합니다. 수집된 각 시점을 28.5°C의 배아 배지에서 별도의 페트리 접시에 보관합니다.
5. 원하는 경우 유전 물질의 미세 주입을 수행하거나 실험 배양 배지에 배치하고 28.5 ° C에서 10cm 페트리 접시에서 신선한 행크 배아 배지의 배아를 배양합니다 .
   참고: morpholino (MO) 주입 또는 돌연변이 동물의 유전자 발현 분석의 경우, 각 조작이 유전자 발현에 부수적인 영향을 미칠 수 있습니다. 돌연변이는 MO 기반 유전자 표적화에 의해 관찰되지 않는 전사 수준에서 유전적 보상을 나타낼 수 있습니다.

2. 배아 단계

1. 모든 배아의 일관된 발달 시기를 촉진하기 위해 10cm 페트리 접시당 50-75개의 배아 그룹으로 배아를 배양합니다.
2. 발달 진행을 보장하기 위해 배반구, epiboly 및 somite 단계에서 해부 현미경을 사용하여 발달 형태를 모니터링합니다.
   알림: 접시의 발달 지연을 방지하기 위해 죽거나 기형인 배아를 제거하십시오.
3. 발달 연령에 따라 배아를 분리합니다. 배아와 유충을 24hpf.
   후 총 몸 길이를 사용하여 병기시킵니다. 참고: 소미테(somites)는 배아의 등쪽 부분에 존재하는 갈매기 모양의 중배엽 조직입니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
ins2a:m체리	지르크	ZL1483
짝지어주는 탱크 1.0L 교차하는 탱크 세트	아쿠아니어링	ZHCT100
해부 현미경	자이스