테일 클립에서 DNA 추출: 제브라피시 유전형 분석에 사용되는 방법

초록

출처: Xing L., et al. 고해상도 용융 분석과 함께 PCR을 사용한 빠르고 효율적인 제브라피시 유전형 분석. J. Vis. 특급 (2014).

이 기사는 제브라피시 꼬리 클립에서 DNA를 추출하는 방법에 대해 설명합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 유전자형을 빠르고 효율적으로 분석하는 방법을 보여줍니다.

프로토콜

1. DNA 준비

1. DNA 용해 완충액 준비: 50 mM KCl, 10 mM Tris-HCl pH 8.3, 0.3% 트윈 20, 0.3% NP40. 사용 당일 새로운 Proteinase K를 최종 농도 1mg/ml로 첨가하십시오.
2. 조직 수집:
   1. 성인 물고기 지느러미 클립의 경우:
      1. 물고기 마취: 물고기를 0.004% MS-222(트리카인) 용액에 넣습니다. 아가미의 움직임이 느려질 때까지 기다립니다.
      2. 5-10 개의 Kimwipes 스택에 물고기를 넣고 멸균 면도날로 약 2-3mm의 꼬리 지느러미의 작은 조각을 자릅니다.
      3. 회수를 위해 담수가 담긴 라벨이 붙은 수조에 물고기를 빠르게 넣으십시오. 수조와 지느러미 클립을 포함할 해당 튜브에 조심스럽게 라벨을 붙입니다. 격일로 물을 갈아주고 물고기에게 먹이를 주세요.
      4. 멸균 피펫 팁으로 핀 클립을 집어 100μl DNA 용해 완충액으로 채워진 튜브로 옮깁니다.
      5. 피펫 끝을 버리고 면도날을 날카로운 물건 용기에 버리십시오.
   2. 배아 꼬리 클립의 경우:
      1. 배아를 0.004% MS-222(트리카인) 용액에 넣습니다. 2분 동안 기다립니다.
      2. 해부 현미경으로 집게로 꼬리 조각을 자릅니다.
      3. 30μl DNA 용해 완충액으로 채워진 라벨이 붙은 튜브에 꼬리를 넣습니다.
      4. 배아를 100μl 4% 파라포름알데히드가 들어 있는 튜브에 빠르게 넣습니다.
      5. 배아와 해당 꼬리 튜브가 있는 튜브에 라벨을 붙입니다.
      6. 고정을 위해 배아가 든 튜브를 4°C에서 밤새 보관하십시오.
      7. 오염을 최소화하기 위해 각 배아 사이에 Milli-Q 물과 Kimwipes를 사용하여 겸자를 세척합니다.
   3. 전체 배아의 경우:
      1. 배아를 0.004% MS-222(트리카인) 용액에 넣습니다. 2분 동안 기다립니다.
      2. 100 μl DNA 용해 완충액으로 채워진 튜브에 1-5개의 배아를 넣습니다. 단언은 필요하지 않습니다.
3. DNA 분해
   조직(지느러미 또는 꼬리 클립 또는 배아)이 있는 튜브를 55°C에서 4시간에서 최대 하룻밤 동안 배양합니다.
4. 단백질분해효소 K
   비활성화 튜브를 95°C에서 15분 동안 가열합니다. DNA는 PCR에 즉시 사용하거나 -20°C에서 최대 3개월 동안 보관해야 합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 리액션 라이트스캐너 마스터 믹스	바이오파이어	HRLS-ASY-0002	www.biofiredx.com
트리카인
파라포름알데히드