광시트 현미경 시료 전처리: 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 장착

초록

출처: Icha J., et al. 제브라피시 눈 발달을 이미지화하기 위해 광시트 형광 현미경 사용. J. Vis. 특급 (2016).

이 기사는 광시트 형광 현미경 검사를 위한 시료 준비에 대해 설명합니다. 또한 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 보여주며, 이를 통해 거의 생리학적 조건에서 살아있는 배아의 긴 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다.

프로토콜

1. 샘플 준비

1. 아가로스 믹스 준비하기
   1. 아가로스 혼합물을 만들기 15분 전에 70°C로 설정된 가열 블록에서 1% 저융점 아가로스(E3 배지에 용해됨)의 1ml 분취액 1개를 녹입니다. 아가로스가 완전히 용융되면 600μl를 새로운 1.5ml 튜브에 옮기고 250μl의 E3 배지, 50μl의 0.4% MS-222 및 25μl의 볼텍스 비드 스톡 용액을 추가합니다.
      메모: 이것은 925 μl의 혼합물을 만드는 반면, 나중에 배아와 함께 첨가된 액체에 대해 추가로 75 μl가 계산됩니다.
   2. 튜브를 38-40 °C의 두 번째 가열 블록에 보관하거나 샘플 배아를 넣기 전에 아가로스가 겔화 점에 매우 가까운지 확인하십시오.
2. 배아를 장착하다
   1. 20μl 부피(검은색 표시, 내경 ~1mm)의 유리 모세관 5개를 가져와서 일치하는 테프론 팁 플런저를 삽입합니다. 테프론 팁이 모세관 바닥에 오도록 플런저를 모세관을 통해 밀어 넣습니다.
   2. 유리 또는 플라스틱 피펫을 사용하여 5개의 배아(한 번에 장착할 수 있는 숫자)를 와류형 37°C의 따뜻한 아가로스 믹스 튜브에 옮깁니다.
      

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Lightsheet Z.1 현미경	Carl Zeiss 현미경 검사
낮은 융점 아가로스	로스	6351.1
낮은 융점 아가로스	시그마	A4018 또는 A9414
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(MESAB/MS-222/Tricaine)	시그마	E10521
20 μL (1 mm 내경, 검정색으로 표시) 캐피들	낙인	701904	Transferpettor의 예비 부품으로 판매
20μl 모세관용 테프론 팁 플런저	낙인	701932	Transferpettor의 예비 부품으로 판매