광시트 현미경 시료 전처리: 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 장착

Abstract

출처: Icha J., et al. 제브라피시 눈 발달을 이미지화하기 위해 광시트 형광 현미경 사용. J. Vis. 특급 (2016).

이 기사는 광시트 형광 현미경 검사를 위한 시료 준비에 대해 설명합니다. 또한 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 보여주며, 이를 통해 거의 생리학적 조건에서 살아있는 배아의 긴 타임랩스 동영상을 녹화할 수 있습니다.

Protocol

1. 샘플 준비

1. 아가로스 믹스 준비하기
   1. 아가로스 혼합물을 만들기 15분 전에 70°C로 설정된 가열 블록에서 1% 저융점 아가로스(E3 배지에 용해됨)의 1ml 분취액 1개를 녹입니다. 아가로스가 완전히 용융되면 600μl를 새로운 1.5ml 튜브에 옮기고 250μl의 E3 배지, 50μl의 0.4% MS-222 및 25μl의 볼텍스 비드 스톡 용액을 추가합니다.
      메모: 이것은 925 μl의 혼합물을 만드는 반면, 나중에 배아와 함께 첨가된 액체에 대해 추가로 75 μl가 계산됩니다.
   2. 튜브를 38-40 °C의 두 번째 가열 블록에 보관하거나 샘플 배아를 넣기 전에 아가로스가 겔화 점에 매우 가까운지 확인하십시오.
2. 배아를 장착하다
   1. 20μl 부피(검은색 표시, 내경 ~1mm)의 유리 모세관 5개를 가져와서 일치하는 테프론 팁 플런저를 삽입합니다. 테프론 팁이 모세관 바닥에 오도록 플런저를 모세관을 통해 밀어 넣습니다.
   2. 유리 또는 플라스틱 피펫을 사용하여 5개의 배아(한 번에 장착할 수 있는 숫자)를 와류형 37°C의 따뜻한 아가로스 믹스 튜브에 옮깁니다.
      메모: 배아와 함께 최소한의 액체를 운반하도록 노력하십시오.
   3. 모세관을 혼합물에 삽입하고 플런저를 위로 당겨 배아 하나를 빨아들입니다. 배아의 머리가 꼬리보다 먼저 모세혈관에 들어가는지 확인하십시오. 플런저와 샘플 사이에 기포가 생기지 않도록 하십시오. 배아 위에는 ±2cm, 아래에는 ±1cm의 아가로스가 있어야 합니다. 나머지 배아에 대해 반복합니다.
   4. 아가로스가 완전히 응고될 때까지 기다렸다가 몇 분 안에 샘플을 플라스틱 또는 테이프로 비커 벽에 붙여서 E3 매체에 보관하십시오. 모세관의 하단 개구부는 샘플로 가스를 교환할 수 있도록 용액에 자유롭게 매달려 있어야 합니다.
      참고: 섹션 1.1 및 1.2와 유사한 프로토콜은 OpenSPIM 위키 페이지 http://openspim.org/Zebrafish_embryo_sample_preparation 에서도 찾을 수 있습니다.

2. 샘플 포지셔닝

1. Sample Holder Assembly (샘플 홀더 어셈블리)
   1. 올바른 크기(검은색)의 플라스틱 슬리브 2개를 샘플 홀더 스템에 서로 마주 보고 삽입합니다. 슬릿 측면은 바깥쪽을 향해야 합니다. cl 부착amp 나사를 2-3바퀴 돌려 느슨하게 조입니다. cl을 통해 모세관을 삽입하십시오.amp 나사를 조이고 반대쪽에 검은색 띠가 보일 때까지 홀더를 통해 밀어 넣습니다. 플런저를 만지지 마십시오.
   2. cl을 조입니다.amp 나사. 배아 아래에 있는 1cm의 여분의 아가로스를 모세혈관 밖으로 밀어내고 자릅니다. s에 줄기를 삽입하십시오.amp르 홀더 디스크.
   3. 소프트웨어에서 현미경 스테이지가 로드 위치에 있는지 확인합니다. 안내 레일을 사용하여 샘플이 있는 전체 홀더를 현미경 안으로 수직으로 미끄러지듯 밀어 넣습니다. 마그네틱 홀더 디스크가 제자리에 고정되도록 돌립니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lightsheet Z.1 현미경	Carl Zeiss 현미경 검사
낮은 융점 아가로스	로스	6351.1
낮은 융점 아가로스	시그마	A4018 또는 A9414
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(MESAB/MS-222/Tricaine)	시그마	E10521
20 μL (1 mm 내경, 검정색으로 표시) 캐피들	낙인	701904	Transferpettor의 예비 부품으로 판매
20μl 모세관용 테프론 팁 플런저	낙인	701932	Transferpettor의 예비 부품으로 판매