Layered Agar Mounting: 도립 현미경을 사용한 장기 이미징을 위한 살아있는 제브라피시 배아 준비

초록

출처: Upadhyay S., et.al. 전체 제브라피시 배아의 확장된 타임랩스 컨포칼 현미경을 위한 계층화 장착 방법. J. Vis. 특급 (2020).

이 기사에서는 장기 이미징을 위해 살아있는 제브라피시 배아를 장착하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 비용 효율적이며 도립 현미경에서 이미징하기 위해 일반 유리 바닥 현미경 접시를 사용하여 쉽게 수행할 수 있습니다. 장착은 서로 다른 농도의 아가로스 층에서 수행됩니다.

프로토콜

1. 배아의 준비

1. 짝짓기 후 페트리 접시에서 E3의 배아를 채취하고 장착하기 전에 약 26.5 ° C에서 약 28 시간 동안 배양합니다.
   메모: 이것은 배아의 발달을 늦추어 배아가 이미징 시작 시 약 30 소미테 단계에 있게 합니다.
2. E3에서 0.016-0.020% 트리카인으로 배아를 마취합니다. 색소 침착을 억제하려면 PTU를 200μM 농도로 첨가하십시오.
3. 해부 현미경으로 겸자를 사용하여 배아를 분리하십시오. 두 개의 집게를 사용하여 융모막을 잡고 부드럽게 당겨 배아를 분리합니다.

2. 아가로스에 장착

참고: 개발된 장착 방법은 필요에 따라 0.02% 트리카인과 PTU가 포함된 E3에서 두 가지 농도의 저용융 아가로스를 필요로 합니다. 첫 번째 아가로스 용액은 왜곡과 운동성이 최소인 최적의 농도의 아가로스를 함유하고 있습니다. 최적화는 아래 5단계에 설명되어 있습니다.

1. 두 층(아래 5단계에서 정의된 농도 및 1%)에 대한 아가로스 용액을 65°C로 가열합니다. 배아가 열에 의해 손상되지 않도록 장착 직전에 아가로스를 약 30°C로 식히십시오. 장착하려면 35번 커버 유리 바닥이 있는 0mm 유리 바닥 접시를 사용하십시오. 접시 바닥에 부착된 커버 유리는 배아를 배치해야 하는 10mm 얕은(약 1.2mm 깊이) 우물을 만듭니다.
   메모: 이 경우, 운동성과 왜곡이 가장 적은 농도는 0.025 내지 0.040% 아가로스였다.
2. 유리 피펫 또는 마이크로 피펫을 사용하여 측면이 접시 바닥을 향하도록 배아를 부드럽게 놓습니다. 마이크로피펫을 사용하는 경우 팁의 바깥쪽 부분을 잘라 배아에 맞게 개구부의 크기를 늘립니다(그림 1A). 마이크로피펫으로 남아 있는 E3를 조심스럽게 제거합니다.
3. 배아를 덮기 위해 접시 바닥에 부착된 덮개 유리에 의해 생성된 작은 우물에 첫 번째 아가로스 용액을 추가합니다(그림 1B). 아가로스가 작은 우물을 덮지만 넘치지 않는지 확인하십시오.
4. 작은 우물을 커버 유리(22mm x 22mm)(그림 1C)로 덮어 두 커버 글라스 사이에 배아가 채워진 좁은 아가로스 충전 공간을 만듭니다.
5. 접시 바닥 전체에 커버 유리 위에 1% 아가로스 용액 층을 놓습니다(레이어 2)(그림 1D). 이 층이 굳어지면서 커버 유리가 제자리에 고정됩니다.
6. 시스템의 수분을 유지하기 위해 접시의 나머지 부분을 0.02% 트리카인이 함유된 E3로 채웁니다(레이어 3)(그림 1E).
   메모: 이 설정에서 커버 유리와 1% 아가로스는 바닥 층이 희석되지 않도록 보호합니다.

3. 레이어 1에 대한 아가로스 솔루션 최적화

1. Layer 1에 대한 아가로스의 최적 농도를 식별하려면 다중 스케일 그리드 검색 접근 방식을 사용하십시오. 0.01%에서 1%까지 증가하는 아가로스 농도로 배아를 장착한 후 시야에서 배아 성장 제한 및 운동성에 대한 타임 랩스 이미징을 수행합니다. 왜곡과 운동성이 모두 최소인 농도를 식별합니다.
2. 아가로스의 농도를 더욱 최적화하려면, 3.1단계에서 가장 좋은 것으로 확인된 농도(예: 0.025%, 0.028%, 0.031% 등)에 따라 더 미세한 범위의 아가로스 농도(예: 0.025 - 0.040% 아가로스)를 사용하여 배아를 장착합니다.
   메모: 우리 실험실에서 최적의 아가로스 농도는 약 0.03%였습니다.

결과

그림 1 : 장착 방법에 대한 설명. (A) 35mm 접시의 유리 바닥으로 만들어진 작은 우물에 제브라피시 배아를 추가합니다. (B) 배아를 덮기 위해 작은 우물에 아가로스 층 1을 추가합니다. (C) 작은 우물 위에 덮개 유리를 조심스럽게 놓습니다. (D) 2mm 접시의 바닥 전체에 아가로스 레이어 35를 추가합니다. (E) 접시에 E3를 추가합니다. (F) 장착 설정의 단면에 대한 개략도. (G) 최종 몽타주에 있는 제브라피시 배아의 현미경 이미지(5x 대물렌즈).

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
저융점 아가로스	시그마-알드리치, 미주리	A9414	용해된 용액을 4°C에서 보관하십시오
No. 0 커버슬립과 10mm 직경의 유리 바닥이 있는 35mm 유리 바닥 접시	MatTek Corporation, 매사추세츠	P35GCOL-0-10-씨
트리카인(MS-222)	시그마-알드리치, 미주리	E10521	용해된 용액을 4°C에서 보관하십시오
N-페닐티오우레아(PTU)	시그마-알드리치, 미주리	P7629	용존 용액을 -20°C에서 보관하십시오
DMC4500 디지털 현미경 카메라	라이카	해당 없음
마이크로 커버 유리 22x22mm	폭스바겐	48366 067