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1. 현미경 설정, 이미지 획득, 처리 및 분석
- 0.8% 저융점(LMP) 아가로스 준비: 100ml E3에 0.8g의 LMP 아가로스를 넣고 완전히 용해될 때까지 가열합니다. 뜨거울 때 37°C 가열 블록에서 1.5ml 마이크로분리 튜브에 LMP 아가로스 1ml를 분취합니다. LMP 아가로스는 37°C에서 용융된 상태로 유지됩니다. 37°C에서 LMP 아가로스 분취액 1ml에 4mg/ml(25x) 40μl, pH 7.0 트리카인을 추가합니다. 참고: 착색된 균주로 작업하는 경우 각 1ml 분취액에 20μl의 0.15%(50x) PTU를 추가합니다.
- 남은 LMP 아가로스를 밀봉된 50ml 튜브에 4°C에서 몇 달 동안 보관하십시오.
- 배아가 이미 들어 있는 25ml의 E3에 1ml의 4mg/ml(25x), pH 7.0 트리카인을 첨가하여 이미지화할 파라바이오틱 배아를 마취합니다.
- 배아가 가운데에 고일 수 있도록 접시를 부드럽게 휘젓습니다. 그런 다음 끝이 넓은 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 가능한 한 적은 액체로 배아를 추출합니다. 피펫을 똑바로 세우고 배아를 부드럽게 튕겨 피펫의 맨 아래에 안착되도록 합니다.
- 배아를 피펫 바닥에 놓고 피펫 팁을 아가로스 표면에 가볍게 터치하여 LMP 아가로스 1ml 분취액으로 옮깁니다. 과도한 액체를 옮기면 아가로스가 희석될 수 있으므로 피하십시오.
- 피펫에서 여분의 액체를 배출한 후 피펫을 사용하여 아가로스 내의 배아를 부드럽게 혼합한 다음 피펫을 사용하여 모든 아가로스와 배아를 유리 바닥(No. 1.5 커버슬립), 6웰 플레이트의 웰로 옮깁니다.
메모: 배아를 이미징 플레이트로 이식한 후 피펫을 폐기하십시오. 잔류 아가로스는 피펫 내부에 갇혀 더 이상 사용할 수 없게 됩니다. 오히려 매번 새 피펫을 사용하십시오.
- 입체경 아래에서 나무 손잡이 티징 바늘 끝에 고정된 젤 로딩 피펫 팁을 사용하여 배아를 커버 유리 쪽으로 배치하고(현미경 대물렌즈의 작동 거리 내에 있는지 확인하기 위해) 이미징을 위해 원하는 방향으로 배치합니다.
메모: 아가로스가 완전히 굳을 때까지 계속 위치를 변경합니다. 한 쌍의 배아를 이미지화할 파라바이오틱 배아를 장착하도록 주의하십시오. 결합된 배아의 무작위 방향을 감안할 때, 일부 쌍의 경우 두 배아를 모두 이미지화하는 것이 어려울 수 있습니다. 이 시나리오에서는 겸자와 끝이 넓은 플라스틱 이송 피펫을 사용하여 아가로스에서 배아를 회수한 다음 다른 관점에서 이미징하기 위해 다시 장착합니다.
- 아가로스가 굳으면 트리카인(필요한 경우 PTU)이 보충된 E3 2-3ml로 덮습니다.
- inverted wide-field epi-fluorescence, laser-scanning confocal 또는 spinning disk confocal microscope를 사용하여 배아를 이미지화합니다. 원하는 이미징에 가장 적합한 대물렌즈를 선택합니다. 전체 배아 시야의 경우 4x 대물렌즈를 사용합니다. 20x 대물렌즈와 같은 더 높은 배율을 선택하여 특정 조직
이미지를 생성합니다.
메모: 정립 현미경을 사용하는 경우 LMP 아가로스(위와 유사)를 유리 커버 슬립에 장착합니다. 동일한 E3-트리카인-PTU로 채워진 진공 그리스 링이 있는 유리 현미경 슬라이드에 유리 커버슬립을 뒤집습니다.
- NIH Image J/FIJI.
와 같은 무료 이미지 분석 소프트웨어 패키지를 사용하여 획득한 이미지 처리
메모: 세포 수를 세고 세분화 및 추적 알고리즘을 사용하여 세포 이동 및 세포 분열과 같은 역학을 정량화합니다.