이광자 레이저 축삭 절개술: 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 축삭 회복을 관찰하는 방법

초록

출처: O'Brien G. S., et al. 살아있는 제브라피시 배아에서 이광자 축삭절개술 및 타임랩스 컨포칼 이미징. J. Vis. 특급 (2009).

이 비디오는 두 개의 광자 레이저 축삭 절개술을 사용하여 제브라피시 배아에서 축삭을 손상시키고 손상으로부터 축삭 회복을 관찰하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1: Chameleon Ti-Sapphire 레이저와 함께 맞춤형 이광자 현미경을 사용한 이광자 축삭절개술

1. 이미징을 준비합니다. 장착된 배아를 현미경 아래의 슬라이드 홀더에 놓습니다. 40X(0.8 NA) 수분 대물렌즈를 가진 하나의 배아에 초점을 맞춥니다. 레이저를 켭니다. 우리는 다음 매개변수를 사용하여 GFP 발현 뉴런을 재현성 있게 시각화하고 손상시킬 수 있었습니다. 손상되지 않는 전력에서 축삭을 시각화하려면 레이저를 910나노미터(nm)의 파장과 30밀리와트의 전력으로 설정합니다(mW는 샘플의 전력량으로 나열됨). 이미징 소프트웨어를 엽니다. 우리는 Karel Svoboda의 실험실에서 개발 된 ScanImage 소프트웨어를 사용합니다.
2. 초점을 눌러 이광자 레이저로 배아를 스캔하고, 축삭 절개술하려는 축삭을 찾고, 이 축삭돌기의 이미지를 캡처합니다. 첫 번째 Z 위치와 마지막 Z 위치를 표시하고, 이미지를 획득하고, Z 스택을 최대로 투영합니다.
3. axotomize하려는 축삭의 가지를 70X 확대하고 스캔을 중지합니다. 샘플의 mW를 180mW의 손상력으로 높이고 레이저로 단일 스캔을 수행합니다. Z 슬라이스 수를 1로 설정하고 "Grab"을 눌러 이 작업을 수행합니다. 이것은 축삭을 절단하기에 충분해야 합니다. 현미경 및 실험....