1: Chameleon Ti-Sapphire 레이저와 함께 맞춤형 이광자 현미경을 사용한 이광자 축삭절개술
- 이미징을 준비합니다. 장착된 배아를 현미경 아래의 슬라이드 홀더에 놓습니다. 40X(0.8 NA) 수분 대물렌즈를 가진 하나의 배아에 초점을 맞춥니다. 레이저를 켭니다. 우리는 다음 매개변수를 사용하여 GFP 발현 뉴런을 재현성 있게 시각화하고 손상시킬 수 있었습니다. 손상되지 않는 전력에서 축삭을 시각화하려면 레이저를 910나노미터(nm)의 파장과 30밀리와트의 전력으로 설정합니다(mW는 샘플의 전력량으로 나열됨). 이미징 소프트웨어를 엽니다. 우리는 Karel Svoboda의 실험실에서 개발 된 ScanImage 소프트웨어를 사용합니다.
- 초점을 눌러 이광자 레이저로 배아를 스캔하고, 축삭 절개술하려는 축삭을 찾고, 이 축삭돌기의 이미지를 캡처합니다. 첫 번째 Z 위치와 마지막 Z 위치를 표시하고, 이미지를 획득하고, Z 스택을 최대로 투영합니다.
- axotomize하려는 축삭의 가지를 70X 확대하고 스캔을 중지합니다. 샘플의 mW를 180mW의 손상력으로 높이고 레이저로 단일 스캔을 수행합니다. Z 슬라이스 수를 1로 설정하고 "Grab"을 눌러 이 작업을 수행합니다. 이것은 축삭을 절단하기에 충분해야 합니다. 현미경 및 실험 목표에 맞게 이 절차를 최적화하는 방법에 대한 논의를 참조하십시오.
- 축소하고 전력을 30mW로 줄인 다음 이미지를 촬영합니다.
2: Zeiss 510 컨포칼/이광자 현미경의 이광자 축삭절개술
- 장착된 배아를 무대에 놓고 25X 물 대물렌즈 또는 기타 적절한 대물렌즈를 사용하여 초점을 맞춥니다.
- 다중 트랙 설정에서 이광자(910nm) 및 아르곤(488nm) 레이저를 켜서 한 레이저에서 다른 레이저로 전환할 수 있습니다. GFP를 감지하기 위해 두 레이저 모두 사용되지만, 두 광자 방출은 빨간색으로 시각화되고 아르곤 레이저 방출은 녹색으로 시각화되어 둘을 구별합니다.
- 아르곤 레이저를 사용하여 손상시킬 축삭을 식별합니다. Z 설정에서 첫 번째 광학 섹션과 마지막 광학 섹션을 표시합니다. 컨포칼 이미지를 가져와서 Z 스택의 최대 투영을 만듭니다.
- 다칠 축삭 부위를 선택하고 이 부위에 초점을 맞춥니다. 아르곤 레이저를 끄고 이광자 레이저를 켭니다. ~9% 투과의 레이저 강도로 이광자로 표본을 스캔하여 축삭돌기가 여전히 초점이 맞는지 확인합니다.
- 자르기 도구를 사용할 수 있도록 "중지" 버튼을 클릭합니다. 자르기를 사용하여 관심 영역을 확대합니다. 일반적으로 ~70X까지 확대/축소합니다(확대/축소는 "모드" 탭에서 확인할 수 있음). "채널" 탭에서 이광자의 강도를 ~9% 투과율에서 15-20% 투과율로 변경합니다.
- 축삭을 절단하려면 "fast XY" 버튼을 약 1초 동안 활성화한 다음 정지 버튼을 눌러 과도한 손상을 방지하십시오. 절차가 효과가 있었다면 축삭돌기는 흩어진 파편으로 보아야 합니다.
- 축삭돌기가 손상되었는지 확인하려면 488nm 아르곤 레이저로 다시 전환하고 다른 컨포칼 이미지를 촬영하여 최대 투영을 생성합니다.