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Abstract

출처: Palanca A. M. S., et al. ChEF-tdTomato를 사용한 제브라피시 체성 감각 뉴런의 광유전학적 활성화. J. Vis. 특급 (2013).

이 비디오는 유전적으로 변형된 체성 감각 뉴런을 활성화하고 유도된 행동 반응을 고속 비디오 카메라로 기록하여 광유전학 기술을 설명합니다.

Protocol

1. 행동 실험을 위한 산유충

1. ddH2O에 1.5% 저용융 아가로스를 만들고 응고를 방지하기 위해 42°C 가열 블록에 보관하십시오.
2. 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 사전 선별된 유충 중 하나를 가능한 한 적은 청색/배아 물이 함유된 1.5% 저용융 아가로스 튜브로 옮깁니다.
3. 아가로스 한 방울에 담긴 유충을 작은 페트리 접시에 옮깁니다.
4. 해부 현미경으로 유충의 등쪽을 위로 향하게 놓습니다.
5. 아가로스가 굳으면 얇은 면도날(#11 메스)로 아가로즈를 잘라내고 유충 전체에 한천 쐐기를 남깁니다.
6. 노른자의 양쪽에 두 개의 대각선으로 자릅니다.유충에 흠집이 나지 않도록 주의하십시오.
7. 아가로스 주변 지역을 배아/푸른 물로 채웁니다.
8. 유충의 몸통과 꼬리에서 아가로스를 당겨 빼냅니다(그림 1).

2 . 고속 카메라 및 이미징 소프트웨어 준비

1. 해부 스코프에 고속 카메라를 장착합니다.
2. 카메라를 컴퓨터에 연결합니다.
3. 컴퓨터를 켭니다.
4. 고속 카메라를 켭니다.
5. 개방형 비디오/이미징 소프트웨어(당사는 AOS 이미징 소프트웨어를 사용하며 여기에서 사용 절차를 설명하지만 다른 이미징 소프트웨어도 동일하게 사용할 수 있음).
6. 그에 따라 카메라 설정을 조정합니다(예: 초당 1,000프레임(fps), 50% 트리거 버퍼 또는 기타 기본 설정).
7. 녹음을 시작합니다.

<p class="jove_title">3. 473nm 레이저를 사용하여 단일 뉴런 활성화

1. 자극기, 레이저 및 광 케이블을 연결합니다.
2. 자극기를 켭니다.
3. 자극기를 최대 5V로 설정하고 펄스 지속 시간을 5msec로 설정합니다.
4. 제조업체의 지침에 따라 레이저를 켭니다.
5. 해부 현미경을 사용하여 ChEF-tdTomato 발현이 있는 뉴런의 세포체 근처에 광학 케이블의 끝을 배치합니다(그림 1).
6. 감각 뉴런을 활성화하기 위해 청색광 펄스를 전달합니다.
7. 초당 500 또는 1,000프레임으로 설정된 고속 카메라를 사용하여 동작을 기록합니다.
8. 습관화를 피하기 위해 각 활성화 사이에 1분을 기다리면서 원하는 대로 실험을 반복합니다. (각 뉴런에 대해 최소 3개의 반응을 기록합니다.)
9. 유충을 풀어 주려면 집게로 아가로즈를 들어 올리고 동물이 다치지 않도록주의하십시오. 이 동물은 더 발달하도록 할 수 있으며 행동의 발달을 특성화하기 위해 더 오래된 단계에서 절차를 반복할 수 있습니다. 배아는 또한 활성화된 세포의 고해상도 컨포칼 이미징을 위해 다시 장착하여 아래와 같이 세포 구조와 행동을 연관시킬 수 있습니다.
10. 유충을 신선한 청색/배아 물과 함께 배양 플레이트로 옮깁니다. 우리는 개별 유충을 추적하기 위해 24웰 플레이트를 사용합니다.

Representative Results

Materials

Low Melt agarose 	Sigma	A9045	or equivalent
Petri dish (100×15 mm)	Any	Any
Non-Sterile scalpel blades	Fine Scientific Tools, Inc.	10011-00	or equivalent
blue/embryo water			10 L ddH2O 0.6 g Instant Ocean 6 drops methylene blue
High speed camera	AOS Technologies, Inc.	X-PRI (130025-10)	or equivalent
Glass Pasteur pipette	Fisher	1367820B	or equivalent (10-15 mm diameter)
473 nm portable laser	Crystal lasers	CL-473-050	or higher power, with TTL option
S48 Stimulator	Astro-Med, Inc. Grass Instrument division	S48K	or equivalent
Tricaine	Sigma	A5040
200 μm optic fiber	ThorLabs	AFS200/220Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
50 μm optic fiber	ThorLabs	AFS50/125Y-CUSTOM	Patch Cord, Length: 3 m, End A: FC/PC, End B: FC/PC, Jacket: FT030
24 culture plates	Genesee	25-102	or equivalent