눈 렌즈 해부: 제브라피시 렌즈 형태를 관찰하는 기술

초록

출처: Vorontsova I. et al, 제브라피시 렌즈 핵 위치 파악 및 봉합 무결성 평가. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 성체 및 유충 제브라피시 렌즈를 해부하여 피질 수정체 형태 및 렌즈 봉합사의 구조적 무결성을 분석하기 위해 개발된 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 유충 및 성인 제브라피시 렌즈 해부

1. 6 dpf 유충에서 성충이 될 때까지 트리카인으로 물고기를 마취하여 접촉에 반응하지 않지만 여전히 강한 심장 박동을 보일 때까지 마취합니다. 스테이징을 위해 Schilling (2002)에 따라 물고기 표준 길이를 측정합니다.
2. 즉시 미세 해부 가위를 사용하여 눈을 절제하고 PBS의 해부 접시에 넣습니다(그림 1은 성인 눈용으로 표시됨).
   1. 렌즈 해부를 위해 실리콘으로 채워진 맞춤형 35mm 접시를 만드십시오. 실리콘이 굳으면 해부 중에 성인의 눈/수정체를 고정할 수 있도록 직경 약 2-3mm, 깊이 0.5mm의 디봇을 절제합니다.
3. 성체 제브라피시 렌즈 해부
   1. PBS로 채워진 접시 디봇 뒤쪽이 위로 향하게 하여 성인의 눈을 놓습니다. 광학 디스크를 통해 <45° 각도로 집게를 삽입하여 눈을 고정합니다. 렌즈에 흠집이 나거나 압축되지 않도록 주의하세요. 절개 가위로 망막과 공막을 통해 시신경 디스크에서 섬모 영역까지 두세 개의 방사상 절개를 만듭니다.
   2. 꽃잎처럼 망막과 공막을 벗겨내고 각막이 위로 향하게 하여 눈을 뒤집습니다. 가위의 평평한 면으로 공막과 각막을 조작하여 간접적으로 수정체를 고정시키고, 집게로 망막과 부착된 조직을 잡아당깁니다. 렌즈에서 여분의 조직을 조심스럽게 다듬습니다.
      메모: 지속적으로 건강한 렌즈를 얻기 위해 주의 깊게 해부하는 것이 중요합니다.
4. 유충 제브라피시 렌즈의 해부
   1. PBS로 채워진 실리콘 접시의 평평한 부분에 유충 눈을 뒤쪽이 위로 향하게 놓고 날카로운 텅스텐 바늘을 사용하여 망막과 공막을 방사형으로 자르면서 다른 텅스텐 바늘이나 집게로 눈을 고정합니다.
      메모: 렌즈가 손상되지 않도록 주의하세요.
      1. 와이어 팁을 10%(w/v) NaOH에 매달고 저전압 교류14를 적용하여 2cm 길이의 0.1mm 텅스텐 와이어 끝을 전기분해로 날카롭게 합니다. 분젠 버너를 사용하여 유리 끝을 녹여 바늘을 파스퇴르 피펫에 고정합니다.
         메모: 대체 미세 해부 도구도 사용할 수 있습니다.
         주의: NaOH는 부식성입니다.
   2. 바늘의 뭉툭한 면으로 해리된 눈에서 수정체를 부드럽게 퍼내고 부착된 조직을 조심스럽게 잡아냅니다.

결과

그림 1: 제브라피시 렌즈 해부. (A) 마취된 물고기에서 눈을 해부하고 후방이 위로 향하게 놓습니다(B). (C) 시신경 디스크(od)를 통해 겸자에 의해 눈을 고정하고 시신경 디스크에서 구역까지 망막과 공막에 2-3개의 방사상 절개를 합니다. (D) 덮개를 접어 렌즈가 보이도록 합니다. (E) 각막을 위로 향하도록 눈을 회전시키고, 각막을 통해 간접적으로 수정체를 고정시키고, 공막을 잡아당깁니다. (F) 수정체에 남아 있는 망막과 섬모 영역/구역을 잘라냅니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
인산염 완충 식염수(PBS)	피셔 사이언티픽	BP399
유리 바닥 마이크로웰 접시(35mm 페트리 접시, 14mm 마이크로웰, #1.5 커버 유리)	MatTek 코퍼레이션	P35G-1.5-14-C
Dumont #5 겸자	Dumont & Fils		겸자를 날카롭게 유지하십시오.
Vannas 미세 해부 가위	테드 펠라 Inc	1346	날카롭고 날카로운 직선 팁
컨포칼 현미경	니콘		이클립스 Ti-E
수산화나트륨 비드	피셔 사이언티픽	시즌 612-3	주의 - 눈과 피부, 표적 기관을 부식성/자극성 - Journal of Visualized Experiments www.jove.com Copyright © 2019 Journal of Visualized Experiments Page 2 of 2 호흡기, 금속 부식성
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