Whole-Cell Patch Clamp 전기생리학: 뉴런의 전기적 특성을 연구하는 방법

초록

출처: Roy, B., et al. 배아 제브라피시 Mauthner 세포의 패치 클램프 녹음. J. Vis. 특급 (2013).

이 프로토콜은 제브라피시 배아에서 Mauthner 뉴런 및 기타 망상 척수 세포의 전기적 특성을 연구하는 방법인 전체 세포 패치 클램프 전기생리학이라는 기술을 설명합니다.

프로토콜

1. 패치 클램프 기록(전체 셀 모드)

1. 모든 녹음은 전체 셀 패치 클램프 모드에서 수행됩니다. 기록 챔버는 전기생리학 설정의 현미경 스테이지에 배치됩니다. 우리의 단계는 고정되어 있으며 직립 패치 클램프 현미경은 이동식 현미경 플랫폼 또는 현미경 변환기에 볼트로 고정되어 있습니다.
2. 패치 클램프 피펫은 수평 풀러(P-97; Sutter Instruments Co.) WPI에서 얻은 얇은 벽의 붕규산 유리에서. 피펫 팁 직경은 부드러운 가장자리로 화재 연마 후 0.2-0.4 μm 정도이며 섕크 테이퍼의 길이는 ~ 4 mm입니다.
3. 피펫을 amp전기생리학 설정의 liifier 헤드 스테이지. 헤드 스테이지를 수평 축에 대해 약 45° 각도로 유지하는 것이 중요한데, 이는 Mauthner 셀에 고저항 씰을 형성하는 데 적합한 피펫의 진입 각도를 보장하기 때문입니다.
4. 수조 용액에 들어가기 직전에 피펫에 소량의 양압을 가하여 팁이 더러워질 가능성을 줄이십시오. mEPSC를 기록할 때 수조 용액에는 활동 전위를 차단하는 1μM TTX, 글리신 수용체를 차단하는 5μM 스트리크닌, GABAA 수용체를 차단하는 10μM 바이큐큘린 또는 100μM 피크로톡신이 포함됩니다. mIPSC를 기록할 때 bath 용액에는 관심 수용체 활성에 따라 1μM TTX, kynurenic acid 및 bicuculline 또는 strychnine이 포함됩니다.
5. 피펫에 소량의 양압으로 M-cell에 접근합니다. 양압은 세포를 좌우로 부드럽게 밀어내고 세포 바로 위에 위치하면 세포막에 작은 보조개를 형성합니다. 피펫을 몇 초 동안 제자리에 두어 세포 표면을 부드럽게 청소하여 피펫과 멤브레인 사이에 강력한 밀봉을 형성할 수 있도록 합니다. 피펫에서 양압을 해제하면 씰이 시작될 수 있으며 음의 피펫 전위와 결합된 소량의 음압으로 인해 몇 초 내에 GigaΩ 씰이 형성됩니다.
6. 증폭기의 유지 전위를 -60mV로 변경합니다. 일련의 짧은 흡입 펄스로 세포막을 파열시킵니다. 멤브레인 전위를 즉시 기록하고 커패시턴스 아티팩트를 최소화합니다. 셀 커패시턴스(Cm) 및 액세스(직렬) 저항(Ra)을 70-85% 보상합니다. Ra는 30초에서 1분마다 정기적으로 모니터링해야 하며, 20% 이상의 변화가 있는 경우 실험을 중단해야 합니다.
7. 실험이 끝나고 충분한 데이터가 수집되면, 한 쌍의 집게로 뒷뇌를 제거함으로써 준비물을 희생합니다. 이 시점에서 데이터 분석을 시작할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
피펫 풀러	셔터 인스트루먼트 공동	P-97
Upright Patch 클램프 현미경	라이카 마이크로시스템즈	증권 시세
증폭기	분자 장치	200ᄂ
마이크로 매니퓰레이터	Siskiyou 주식 회사	MX7500