근육주사(IM) 주사: 성체 제브라피쉬의 등쪽 근육으로 복합 전달

초록

출처: Myllymäki, H., et al. DNA 기반 백신의 전임상 스크리닝을 위한 성인 제브라피시 면역. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 성인 제브라피쉬의 등쪽 근육에 화합물을 전달하기 위한 근육 주사 기술에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. DNA 백신 및 전기천공법 주입

1. 이 프로토콜에 따른 예방 접종을 위해서는 6-12개월 된 건강한 성인 제브라피시를 사용하십시오. 14/10시간 라이트/다크 주기의 플로우 스루 시스템에 물고기를 보관하고 물 1L당 최대 7마리의 물고기를 잡습니다.
2. 물고기를 마취하기 위해 탱크 물에 0.02% 3-아미노벤조산 에틸 에스테르(트리카인) 용액(pH 7)을 준비합니다. 10cm 페트리 접시 또는 이와 유사한 것을 사용하십시오.
3. 5L 비커에 3L의 깨끗한 시스템 물을 채워 회수 탱크를 준비합니다.
4. 예방 접종 중에 물고기가 고정된 위치에 있도록 예방 접종 패딩을 준비하십시오. 5 × 7cm 2cm 두께의 스펀지² 개를 가져 가라. 메스 날이나 날카로운 가위로 스펀지에 홈을 자릅니다.
   메모: 동일한 백신 패딩을 여러 실험에 사용할 수 있습니다. 실험 사이에 스펀지를 70% 에틸 알코올에 담가 소독하고 건조시킵니다.
5. 스펀지를 시스템 물에 완전히 담그고 스폰지를 페트리 접시에 놓습니다.
6. 예방 접종 24시간 전에 물고기를 금식하십시오.
7. 제브라피시 한 마리를 0.02% 트리카인이 함유된 페트리 접시에 올려 마취합니다. 물고기가 터치 자극에 반응하지 않고 아가미의 움직임이 없을 때까지 기다립니다. 한 번에 한 마리의 물고기를 마취하십시오.
8. 플라스틱 숟가락을 사용하여 마취된 제브라피시를 젖은 스펀지에 옮기고 물고기의 복부 쪽을 홈에 넣습니다. 올바른 위치에서 물고기의 머리와 몸통의 대부분이 홈 안에 있고 등지느러미와 꼬리가 홈에서 튀어나와 있는지 확인하십시오.
9. 현미경으로 현미경 아래에서 마이크로 매니퓰레이터의 x축 및 y축 미세 조정 휠을 사용하여 제브라피쉬의 등쪽 근육에 약 45° 각도로 바늘을 조심스럽게 놓습니다.
10. 등지느러미 앞에서 비늘이 없는 작은 점을 찾아 바늘을 밀어도 힘이 필요하지 않습니다. 저항이 느껴지면 인접한 지점을 시도하십시오. 척추, 등지느러미 또는 비늘을 다치지 않도록 하십시오.
    메모: 바늘을 밀면서 구부러지면 바늘을 잘라 바늘을 약간 줄이십시오.
11. 풋 스위치를 사용하여 백신 용액을 근육에 서서히 주입합니다. 현미경을 통해 주입을 관찰하십시오 : 페놀 레드가 근육 조직에 들어갈 때 볼 수 있습니다. 필요한 경우 펄스 지속 시간을 조정합니다.
    메모: 또는 주입을 위해 공압 펌프의 전면 패널에 있는 펄스 개시 버튼을 사용합니다. 그러나 원격 풋 스위치를 사용하면 다른 손을 사용하여 10회전 다이얼 휠로 펄스 길이를 조정할 수 있습니다. 용액을 너무 빨리 주입하면 과도한 조직 손상이 발생할 수 있으므로 피하십시오. 공기를 주입하지 않도록 하십시오.
12. 주입 직후 물고기를 전기천공하십시오. 물고기가 아직 마취 상태인지 확인하십시오. 물고기를 스펀지에 올려놓고 핀셋 형 전극 사이에 물고기를 설정하여 전극이 주입 부위의 양쪽에 위치하도록합니다. 전극 핀셋을 너무 세게 누르지 말고 두 전극이 물고기와 접촉하도록 하십시오.
    1. electroporator의 시작 버튼을 눌러 6개의 40V, 50ms 펄스를 제공합니다.
    2. 물고기를 회수 탱크로 부드럽게 옮깁니다.
    3. 각 electroporation 후에 70% 에탄올로 문질러 전극을 청소하십시오.
       메모: 백신 접종 후 물고기의 복지를 주의 깊게 모니터링하십시오. 불편함의 징후(마취에서 느린 회복, 비정상적인 수영, 헐떡임)를 보이는 물고기를 0.04% 트리카인으로 안락사시킵니다. 회수 후 물고기를 플로우 스루 유닛으로 옮기고 정상적으로 먹이십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
페놀 레드 나트륨 염	시그마-알드리치	114537-5지
트리카인(에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트 염)	시그마	A5040-100G	Anestesia 및 안락사 솔루션
Tweezertrodes 전극(7mm) 키트	BTX 하버드 장치	BTX 450165	핀셋 타입 전극
알루미노실리케이트 모세관	하버드 기구	Tel.: 30-0108
마이크로 매니퓰레이터	나리시게	매사추세츠-153
현미경	올림푸스	ZS61
ECM 일렉트로 스퀘어 포레이터	BTX 하버드 장치	재질 보기 BTX ECM 830
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