배아 미세주입: 제브라피시 노른자에 화합물을 전달하는 기술

초록

출처: Sorlien, E. L., et al. 모델 시스템 Danio rerio에서 CRISPR/Cas9 생성 유전자 녹아웃의 효율적인 생산 및 식별. J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 제브라피시 난황낭에 화합물을 전달하는 배아 미세주입 기술에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. CRISPR 성분을 제브라피시 배아에 미세주입

1. 칸막이가 있는 번식 탱크에 원하는 수컷과 암컷(일반적으로 암컷 2마리와 수컷 1-2마리)의 수를 배치하여 주입 전날 밤에 번식 탱크를 설정합니다.
2. 용융된 아가로스 35mL를 10cm 페트리 접시에 붓고 0.01% 메틸렌 블루(살균제)가 포함된 1x E3 매체(재료 표 참조)에 1.5% 아가로스가 포함된 미세 주입 플레이트를 준비하고 플라스틱 주형을 부드럽게 놓아 용액에 쐐기 모양의 홈통을 만들고 주형을 두드려 기포를 제거합니다.
3. 아가로스가 굳을 때까지 기다렸다가 접시를 소량의 매체와 함께 보관하고 접시가 4°C에서 건조되는 것을 방지하기 위해 파라핀 필름으로 감쌉니다.
   메모: 주입판은 우물이 변형되거나 건조되거나 판이 곰팡이가 자라기 시작할 때까지 몇 주 동안 재사용할 수 있습니다.
4. 주사 아침에 정제된 sgRNA와 Cas9 단백질을 얼음에서 해동합니다. RNase 오염을 방지하기 위해 장갑을 끼고 모든 재료를 취급하고 RNase가 없는 팁과 튜브를 사용하는 것을 잊지 마십시오.
5. Cas9:sgRNA의 2:1 비율로 Cas9 단백질과 sgRNA를 결합하여 5 μL 주입 용액을 생성하면 400 pg/nL Cas9 단백질과 200 pg/nL sgRNA의 최종 농도를 얻을 수 있습니다. Cas9/sgRNA 용액을 실온에서 5분 동안 배양하여 Cas9 및 sgRNA가 리보핵단백질 복합체를 형성할 수 있도록 합니다. 0.5 μL의 2.5% wt/vol 페놀 적색 용액(재료 표 참조)과 RNase-free 물을 5 μL.
   의 최종 부피에 추가합니다. 메모: 용액의 이온 강도는 Cas9/sgRNA complex의 용해도에 영향을 미치는 것으로 나타났으므로 KCl을 추가하면 낮은 indel 형성을 나타내는 sgRNA의 절단 효율을 높일 수 있습니다.
6. 마이크로피펫 풀러를 사용하여 1.0mm 유리 모세관을 당겨 주사 바늘을 만듭니다. 새 면도날이나 집게를 사용하여 갓 만든 바늘 끝을 잘라 융모막과 난황낭을 쉽게 뚫을 수 있는 각진 구멍을 만듭니다.
7. 공기 공급원을 켠 상태에서 마이크로 인젝터에 부착된 미세 조작기에 바늘을 놓습니다. 특정 장치에 대해 결정된 보정에 적합한 배율을 사용하여 광학 현미경 아래에서 바늘이 미네랄 오일로 채워진 페트리 접시에 1nL 용액을 일관되게 배출할 때까지 사출 압력을 조정합니다.
   메모: 바늘의 품질은 매우 중요합니다. 추가 실험을 시도하기 전에 이 기술을 숙달할 때까지 바늘을 만들어 배아의 난황낭에 주입하는 연습을 합니다.
8. 칸막이를 제거하고 물고기가 약 15분 동안 번식하도록 합니다.
   메모: 번식 시간이 길수록 더 많은 배아를 생산할 수 있지만, Cas9 절단이 조기에 발생하여 유전적 모자이크증을 줄일 가능성을 최대화하기 위해 배아가 1세포 단계에 있을 때 주입을 완료해야 합니다. 배아는 후기 단계(2-4 세포 단계)에서 주입할 수 있지만, 이는 변형된 대립유전자의 생식세포 전달률을 감소시킬 수 있습니다.
9. 여과기를 사용하여 계란을 모으고 0.0001% 메틸렌 블루가 함유된 1x E3 매체를 사용하여 10cm 페트리 접시에 헹굽니다. 광학 현미경으로 난자의 건강 상태를 검사하고 수정되지 않은 난자와 부스러기를 제거합니다.
10. 10-15개의 배아를 주입되지 않은 대조군으로 라벨이 붙은 별도의 페트리 접시에 따로 보관합니다.
11. 전사 피펫을 사용하여 실온으로 예열된 주입판에 계란을 부드럽게 정렬합니다.
12. 2.5X 배율의 해부 현미경에서 용액 1nL를 각 배아의 난황낭에 주입하여 총 400pg의 Cas9 단백질과 200pg의 sgRNA를 주입합니다.
    메모: 원하거나 필요한 경우 절단을 늘리려면 주입 용액에서 Cas9 단백질의 최종 농도를 800pg/nL로, sgRNA의 최종 농도를 400pg/nL로 증가시킵니다. 그러나 이것은 또한 off-target 절단을 증가시키거나 배아 건강을 감소시킬 수 있습니다. 절단 효율은 세포에 직접 주입함으로써 증가할 수도 있습니다. 그러나 노른자 자루에 주입하는 것은 기술적으로 덜 까다롭고 생식세포 전달이 높은 물고기를 생산할 수 있을 만큼 충분히 절단할 수 있습니다(변형된 대립유전자를 포함하는 자손의 >70%).
13. 주입된 배아를 적절하게 라벨링된 페트리 접시에 다시 넣고 메틸렌 블루가 함유된 1x E3 배지로 덮고 28°C로 설정된 배아 인큐베이터에 넣습니다.
14. 수정 후 24시간(hpf)에 주입된 배아의 건강 상태를 검사하여 죽거나 비정상적으로 발달하는 개체를 제거하고 배지를 변경합니다(그림 1 참조). 주입되지 않은 대조군에 대한 생존율을 확인합니다.
    메모: 필수적이지 않은 유전자를 표적으로 할 때, 주입되지 않은 대조군에 비해 10% 미만의 치사율이 예상됩니다. 가이드-주입된 집단에서 비주입된 대조군에 비해 높은 수준의 치사율이 관찰되는 경우, 이는 표적 유전자가 발달에 필수적이거나 off-target effect가 발달 실패로 이어지고 있음을 나타낼 수 있습니다. 주입되는 CRISPR-시약의 양을 줄여야 하거나 off-target effect가 감소된 새로운 sgRNA를 생성해야 할 수 있습니다.
15. 배아를 인큐베이터로 되돌리고 배아를 72hpf까지 계속 성장시키며, 배아의 건강을 유지하기 위해 매일 배지를 교체합니다.

결과

그림 1: 주입된 배아 24개의 건강 비교. 24hpf로 발달한 살아있는 배아(A)는 발달이 중단된 배아(B)와 쉽게 구별됩니다. 척추 만곡 또는 머리와 눈의 발달 변화와 같이 (B)와 유사하거나 (A)의 특징이 급격히 변경된 배아는 접시에서 제거해야 합니다

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RNase-free 정제수	모든 브랜드		가이드 RNA의 합성. 온도 Fisher와 Qiagen은 모두 를 운반합니다. 적당한 물.
E3 배아 배지	집에서 만든		배아 사육용 배지 및 injeciton plate. 만들기 조리법: http://cshprotocols.cshlp.org/ content/2011/10/pdb.rec66449
메틸렌 블루	시그마-알드리치	M9140	배아의 진균 성장을 방지하기 위해 1x E3 배지에 추가되었습니다.
페트리 접시	써모 피셔	FB0875711Z	배아 저장, 캐스트 주입 플레이트
아가로스	덴빌	CA3510-8	주조 주입 플레이트, 아가로스 젤.
Microinection 금형	적응형 과학 도구	TU-1	주입 중 배아를 담을 수 있는 웰을 만들기 위해
페놀 레드	시그마-알드리치	P0290	주입 시각화를 위한 염료
미네랄 오일	시그마-알드리치	M5904-5ML	바늘 주입 양을 측정하기 위해.
파이펫 이송	모든 브랜드		움직이는 배아
면도날	써모 피셔	11295-10	절단 주사 바늘, 꼬리 자르기 성인 물고기.
부 화기			28.5°C에서 배아 유지
Verticle 피펫 풀러	David Kopf 악기	700씨	주사를 위한 바늘을 생성하십시오. 추가 바늘 당기는 지침 : http:// cshprotocols.cshlp.org/ content/2006/7/pdb.prot4651.long
모세관	셔터 기기	BF100-58-10	주사를 위한 바늘을 생성하십시오.
마이크로로더 팁	에펜도르프	930001007	용액을 주사 바늘에 넣으십시오.
마이크로인젝터	세계적인 정밀 기기	PV 820	배아 주입.
현미경 해부	라이카		배아 주입.
마이크로파	모든 브랜드		주조 주입 플레이트, 아가로스 젤.
저울	모든 브랜드		주조 주입 플레이트, 아가로스 젤.
장갑	모든 브랜드		프로토콜의 모든 측면.
엔2	모든 브랜드		배아 주입을 위해 모세혈관에서 액체를 배출하기 위해
PCR 스트립 튜브	모든 브랜드		프로토콜의 모든 측면.
200μL 팁	모든 브랜드		프로토콜의 모든 측면.
10μL 팁	모든 브랜드		프로토콜의 모든 측면.
마이크로피펫	모든 브랜드		프로토콜의 모든 측면.

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