제브라피쉬 뇌 해부: 물고기 신경생물학 기법

초록

출처: Lopez-Ramirez M. A. et. al., Isolation and Culture of Adult Zebrafish Brain-derived Neurospheres(성인 제브라피시 뇌 유래 신경구의 격리 및 문화). J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 성인 제브라피시의 뇌를 미세 해부하는 기술을 설명합니다. 이 방법은 더 자세히 연구할 수 있는 전체 뇌 유래 중성구를 얻는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 성인 제브라피시 뇌 해부

1. 100mm x 15mm 페트리 접시에 젤 얼음 팩을 채워 해부 침대를 준비합니다. 그런 다음 페트리 접시에 뚜껑을 덮고 젤이 얼 때까지 -20 ° C에서 배양합니다. 뚜껑 위에 깨끗한 여과지를 정사각형으로 놓고 여과지와 페트리 접시를 모두 플라스틱 필름으로 감쌉니다.
2. 매번 사용하기 전에 모든 현미해부 기구를 70% 에탄올 또는 열로 세척하고 살균하십시오. 모든 멸균된 해부 기구를 해부 현미경 근처에 놓고 안락사 직전에 광섬유 조명이 있는 현미경 아래에 해부 베드를 놓습니다.
3. 전체 뇌 신경구 준비를 위해 성체 제브라피시 2마리를 모으고, 해부된 뇌 영역에서 신경구를 생성하기 위해 3-4마리의 제브라피시를 수집합니다.
4. 성인 제브라피시(8-12개월)를 기관 동물 관리 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)에서 승인한 프로토콜에 따라 안락사시킵니다. 다음으로, 물고기를 75% 에탄올에 5-10초 동안 담그고 재빨리 해부 침대에 넣은 다음 수술용 칼날을 사용하여 아가미 수준에서 참수합니다.
   1. 동물을 안락사시키려면 동물의 심장 박동이 점차 느려지고 혈액 순환이 멈출 때까지 트리카인 메탄설포네이트를 과다 투여한 다음 얼음물에 담그십시오.
5. 머리의 등쪽을 아래로 돌리고 가위를 사용하여 자른 쪽에서 입까지 세로로 자릅니다. 겸자를 사용하면 두개골 기저부가 드러나고 인접한 모든 조직을 제거할 수 있습니다. 척수의 시작 부분에서 구조쪽으로 두개골의 측벽을 자릅니다.
6. 가위를 사용하여 시신경을 자르고 제거한 다음 지각 수준에서 두개골의 가장 외측 부분의 양쪽을 제거합니다. 머리를 복부 쪽을 위로 돌립니다. 집게를 사용하여 두개골의 가장 정점 부분의 나머지 부분을 벗겨냅니다.
7. 두개골의 나머지 부분과 함께 뇌를 해부 매체(페니실린/스트렙토마이신이 있는 DMEM/F12)를 사용하여 새 접시로 옮깁니다. 마이크로 나이프의 플라스틱 손잡이를 사용하여 모든 뇌 구조를 그대로 유지하면서 해부 매체의 뇌 조직을 청소합니다.
8. 이 시점부터 전체 제브라피시 뇌를 사용하여 프로토콜을 계속합니다.
   1. 또는 이 프로토콜을 특정 뇌 영역에 적용하여 전체 제브라피시 뇌 또는 새로운 메스로 절개된 텔렌스팔론, 텍툼/디엔세팔론 또는 소뇌에서 신경구를 생성합니다. 그림 1에 따라 신경 특이적 형광 제브라피시 신경 형질전환 라인을 사용하여 관심 있는 뇌 영역을 해부합니다.

결과

그림 1: 제브라피시 뇌 유래 신경구의 분화.(A-C, E) 1일(A, DiVd1), 3일(B, DiVd3) 및 4일(C 및 D, DiVd4) 동안 Z-분화 매질에서 배양된 전체 뇌 유래 신경구의 위상차 이미지. (E) 12개월 된 Tg(GFAP:DsRed) 제브라피쉬의 전체 뇌의 등쪽 보기. 텔렌스팔론(tel), 텍툼(tectum, Tec) 및 소뇌(Cer)를 그림과 같이 해부하고 수집하였다. (D) 통로 0 (P0), 1 (P1) 및 2 (P2)에서 tectum, telencephal...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM/F12 1배	생명 기술	제11330-032
페니실린-스트렙토마이신	생명 기술	15140-122
트리카인 MS-222	시그마	A5040	4 mg/ml의 원액

호 년