정소주사: 성체 마우스에 조직 특이적 암세포 이식

초록

출처: Katsuta, E., et al. 쥐 정소성 전이성 유방암 모델 생성 및 쥐 근치적 유방 절제술 수행.J. Vis. 특급(2018).

이 비디오는 마우스 모델에서 유방암 정소성 접종 기술을 보여줍니다. 이 기술은 피하 또는 비수술적 주사에 비해 종양 크기와 모양의 변동성이 적고 높은 종양 형성률을 생성합니다.

프로토콜

1. 세포 준비 (10 마우스 용)

참고: 세포 생존력 감소를 방지하기 위해 접시에서 분리된 후 1시간 이내에 세포를 접종해야 합니다. 구체적으로, 세포 현탁액은 생존력을 유지하기 위해 접시에서 세포를 분리한 후 15분 이내에 젤라틴 단백질 혼합물에 혼합되어야 합니다.

1. 루시페라아제를 발현하는 마우스 유방 선암 세포주인 4T1-luc2 세포를 37°C의 가습 인큐베이터에서 5%_CO2로 10% FBS로 RPMI 1640 배지에 배양합니다.
2. 10mL 혈청학 피펫을 사용하여 인산염 완충 식염수(PBS)가 있는 10cm 접시에 부착된 4T1-luc2 세포를 세척합니다. P1000 피펫을 사용하여 0.25% 트립신 1mL를 첨가한 다음 37°C에서 5분 동안 샘플을 배양합니다. 그런 다음 5mL 혈청학적 피펫을 사용하여 4mL의 성장 배지(10% FBS가 포함된 RPMI-1640)를 추가하고 세포 현탁액을 조직 배양 후드의 15mL 원뿔형 튜브로 옮깁니다. 셀 현탁액을 180 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
3. 상층액을 흡인하고 PBS 2mL에 세포를 재현탁시킨 다음 혈구계를 사용하여 세포를 계수합니다.
4. 조직 배양 후드에서 40μL의 차가운 PBS(pH 7.4, 4°C)에 2 x 10⁶ 4T1-luc2 세포를 현탁합니다.
5. 조직 배양 후드의 얼음 위에 1.5mL 마이크로 원심분리기 튜브에 40μL 세포 현탁액과 360μL의 젤라틴 단백질 혼합물을 혼합합니다.
   참고: 최종 농도는 1 x 10⁵/20 μL(1:9 PBS:젤라틴 단백질 혼합물)입니다. 정소성 모델(유방 절제술 없음)의 경우, 2주 이내에 안락사 기준(종양 크기 > 2cm)에 도달하는 것을 피하기 위해 최종 농도의 1 x 10⁴/20 μL를 사용했습니다.

2. 암세포 접종

1. 마우스가 침착하게 호흡할 때까지(2-3분) 2-4% 이소플루란과 0.2L/min 산소 흐름으로 마우스를 마취 유도실에 넣습니다.
2. 마우스를 잡고 0.05mg/kg의 부프레노르핀을 어깨에 피하로 주사합니다.
3. 발가락 꼬집음에 대한 반응이 없어 적절한 마취를 확인하십시오. 숯 용기 장치에 부착된 2-4% 이소플루란과 2L/min 산소 흐름으로 흡입 마취가 가능한 마우스 마스크의 구멍에 마우스의 코를 삽입합니다.
4. 실험실 테이프를 사용하여 쥐의 팔다리를 구속하고 면봉을 사용하여 클로르헥시딘, 요오드 및 75% 에탄올을 사용하여 피부를 살균합니다.
5. 멸균 현미해부 가위를 이용하여 전방 흉벽 중앙을 5mm 절개하고, 절개 부위 옆의 오른쪽 피부를 들어 올려 가위로 흉벽에서 피부를 분리한 후 피부를 반전시켜 우측 #2 유방 지방 패드를 노출시킵니다.
6. 28.5G 바늘이 있는 1mL 인슐린 주사기를 사용하여 20μL의 암세포 현탁액을 상처를 통해 직접 볼 수 있는 지방 패드에 조심스럽게 주입합니다.
   참고: 바늘은 피부가 아니라 상처를 통과합니다. 바늘을 빼내기 전에 지방 패드에 바늘을 5초 동안 계속 대고 있으면 젤라틴 단백질 혼합물이 응고될 시간을 가질 수 있습니다.
7. 멸균 5-0 비흡수성 봉합사를 사용하여 꿰매어 절개 부위를 닫습니다.
8. 수술 후 동물을 깨끗한 우리로 되돌리고 회복되어 자유롭게 움직일 때까지 모니터링합니다(~1-2분 후).수술 후 24시간 이내에 동물의 건강이 좋지 않은 것 같으면 부프레노르핀(0.2mg/kg)을 투여합니다.
9. 수술 후 마취 상태에서 봉합사를 제거합니다(2.1단계 참조) 7일 후.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
마이크로 해부 가위	로보즈	RS-5983	암세포 접종 및 유방 절제술에
5-0 실크 봉합사	일견	774B F
로스웰 파크 기념관 1640	지브코	11875093	세포 배양용
소 태아 세럼	지브코	10437028	세포 배양용
트립신-EDTA (0.25%)	지브코	25200056	세포 배양용
건조 살균제(Germinator 500)	브레인트리 사이언티픽	독일 5287-120V	암세포 접종 및 유방 절제술에
바늘 홀더	로보즈	RS-7830	암세포 접종 및 유방 절제술에
애드슨 겸자	로보즈	RS-5233	암세포 접종 및 유방 절제술에
클리퍼	왈	9908-717	암세포 접종 및 유방 절제술에
마트리겔	코 닝	354234	암세포 접종을 위해