직접 상호작용을 통한 3D 공동 배양: 암세포와 단핵구의 상호작용을 연구하기 위한 공동 배양

초록

출처: Espinoza-Sánchez, et al. 세포외 기질 추출물(ECME) 기반 3차원 시스템에서 단핵구와 원발성 유방암 세포 간의 통신 분석. (2018).

이 비디오는 세포외 기질 추출물(ECME) 기반 환경에서 유방암 세포와 단핵구의 상호 작용을 연구하기 위한 3D 공동 배양에 대해 설명합니다. 이 방법은 콜라겐 분해, 면역 세포 동원 및 세포 침입과 같은 특정 기능을 연구하는 데 도움이 됩니다.

프로토콜

1. 3D 직접적인 상호 작용이 있는 공동 문화

1. 세포 배양 전에 BrC 세포와 단핵구를 서로 다른 형광 염료로 라벨링하여 mRNA 및 단백질 발현 분석을 위해 배양 후 각 세포 계통을 독립적으로 분류할 수 있습니다. 살아있는 세포의 세포막을 자유롭게 통과하는 시판되는 쿠마린과 로다민의 유도체를 사용하십시오. 라벨링을 위한 일반적인 프로토콜은 다음과 같습니다.
   1. 관심 BrC 세포의 단층(25cm² 배양 플라스크에 2 × 10⁶개 세포)을 준비하고 표준 배지를 형광 염료의 충분한 예열 작업 용액(보충제 없이 표준 기본 배지의 형광 염료 1:2,000)으로 교체합니다. 가습 된 5 % CO₂ 환경에서 37 ° C에서 30 분 동안 배양하십시오. 염료 용액을 흡입하고 충분한 1x PBS로 부드럽게 헹굽니다. PBS를 흡입하고 표준 매체를 추가합니다.
   2. 37°C에서 5-10분 동안 0.05% 트립신 용액 2mL와 0.48mM EDTA 용액 2mL로 세포 단층을 트립신화합니다. 트립신화를 중지하기 위해 FBS 200μL를 추가하고 보충제 없이 해당 배지 7mL를 추가합니다. 피펫팅으로 세포를 재현탁합니다. 10 μL의 부분 표본을 취하여 Neubauer 챔버의 세포 계수를 수행합니다. 세포 계수 후 공동 배양 프로토콜을 계속합니다.
   3. RT에서 5분 동안 430 x g에서 세포를 펠렛화합니다(단핵구가 현탁액에서 성장하기 때문에 먼저 이 작업을 수행). 상등액을 버리고 미리 데워진 형광 염료 작업 용액 3mL(보충제가 없는 표준 염기 배지에서 형광 염료 1:2,000)로 세포를 부드럽게 재현탁합니다. 가습 된 5 % CO₂ 환경에서 37 ° C에서 30 분 동안 배양합니다.
   4. 세포를 다시 펠렛화하고 염료 작업 용액을 버리고 5-7mL의 1x PBS로 부드럽게 재현탁합니다. 한 번 더 펠렛화하고 PBS를 버리고 5-7mL의 표준 배지에 세포를 재현탁합니다. 10 μL의 세포 현탁액의 분취액을 취하여 Neubauer 챔버의 세포를 계수합니다. 세포 계수 후 공동 배양 프로토콜을 계속합니다.
2. 공동 배양을 다음과 같이 설정합니다: 4웰 챔버 슬라이드 시스템의 각 웰에 균일한 층을 형성하기 위해 웰 바닥에 충분한 ECME를 퍼뜨립니다. 웰당 5 × 10⁵개의 라벨링된 BrC 세포를 포함하는 단일 세포 현탁액의 플레이트 20 μL.
3. 37°C에서 15-20분 배양 후 80μL 분석 배지에 2.5 x 10⁵ 표지된 단핵구의 현탁액을 추가합니다(60% ECME가 보충됨).
4. ECME가 37°C에서 15-20분 동안 응고되도록 합니다.
5. BrC 세포와 단핵구 배양 배지의 1:1 혼합물 1mL를 추가합니다.
6. 37°C의 가습된 5% CO₂ 환경에서 24시간, 48시간 또는 5일 동안 공동 배양을 배양하여 다른 시점의 변화를 추적합니다.
7. ECM 단백질을 분해하여 배양물에서 세포를 회수합니다. 배지를 흡입 및 버리고 0.1% 트립신 및 0.25% EDTA가 포함된 1x PBS 0.5mL를 첨가하고 37°C에서 3시간 동안 배양합니다. 배양 후 0.5mL의 1x PBS와 10% FBS를 첨가하여 트립신을 중화하고 격렬하게 피펫팅하여 세포를 재현탁하여 단일 세포 현탁액을 얻습니다.
8. RT에서 5분 동안 765 x g의 펠렛 세포를 투여하고, 상층액을 버리고, 10% FBS가 함유된 5mL의 1x PBS에 세포를 재현탁합니다. 이 단계를 한 번 반복합니다.
9. 적절한 기기를 사용하여 세포 현탁액에 FACS(Fluorescence-activated cell sorting)를 적용합니다. 최종 모집단이 95% 이상 순수한지 확인).
10. 분류 후 멸균 1x PBS, 펠렛(RT에서 5분 동안 430 x g)으로 세포를 세척하고 멸균 1x PBS에 재현탁합니다. 세포는 RNA 분리 또는 단백질 분석을 위한 특정 프로토콜에 따라 처리할 수 있습니다.
11. 각 개별 세포 계통의 3D 배양을 대조군으로 포함하여 각 분석을 세 번 반복합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
U937	아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC	CRL-1593.2	단핵세포주/조직세포 림프종
증권 시세 표시기-1	아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC	TIB-202	단핵세포주/급성 단핵구 백혈병
MCF-10ᅡ	아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC	CRL-10317 (영문	비형질전환된 유방 세포주
MCF-7	아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC	HTB-22	유방암 세포주
MDA-MB-231	아메리칸 타입 컬처 컬렉션 ATCC	증권 시세 표시기 HTB-26	유방암 세포주
RPMI 1640 배지	GIBCO BRL 생명 기술	11875-093
DMEM/F12	GIBCO BRL 생명 기술	11039-021
항생제/항진균제	GIBCO BRL 생명 기술	제15240-062	100 U/mL 페니실린, 100 μg/mL 스트렙토마이신 및 0.25 μg/mL 곰팡이
소 태아 세럼	GIBCO BRL 생명 기술	제16000-044
호스 세럼	GIBCO BRL 생명 기술	16050114
0.05% 트립신-EDTA 1X	GIBCO BRL 생명 기술	제25300-062
PBS 1X(인산염 완충 식염수	GIBCO BRL 생명 기술	20012-027
표피 성장 인자(EGF)	페프로텍	AF-100-15 (1.00mg)
인슐린	시그마-알드리치	I1882-100MG
하이드로코르티손	시그마-알드리치	H088-5G
콜레라 독소 Vibrio cholerae	시그마-알드리치	C8052-1MG
마트리겔	코닝 Inc	356237	Engelbreth-Holm-Swarm (EHS) 마우스 육종, 세포외 기질 추출물, -20°C에서 보관하고 4°C에서 사용할 때까지
Lab-Tek 챔버 슬라이드(커버 포함)(8웰)	날지 눙크 인터내셔널	177402

) 시리즈 년 년 호 호 호 년