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1. 탈세포화
참고: 이 절차는 DNA를 효율적으로 제거하기 위해 도데실황산나트륨 대신 데옥시콜레이트 나트륨 이온 세제를 포함하는 지방 탈세포화에 초점을 맞춘 이전에 발표된 방법을 채택한 것입니다.
- 1일차에 -80°C에서 얼린 유방 지방 패드 또는 MFP를 제거하고 실온에서 해동합니다.
- 해동되면 섬세한 작업용 와이프로 MFP를 잠시 건조시킵니다. 분석 저울을 사용하여 MFP를 계량합니다.
- 가위나 메스가 있는 집게를 사용하여 조직을 온전한 ECM 연구를 위해 3mm x 3mm x 3mm 샘플로 나누고 하이드로겔 생산을 위한 나머지 조직을 연구합니다.
메모: 샘플의 수는 테스트 방법의 수에 따라 달라지며, 예를 들어 두 샘플의 수집은 아래에 설명되어 있습니다: 하나는 파라핀 포매ing(단계 1.5)이고 다른 하나는 원하는 경우 cryostat embedding medium에서 동결하기 위한 것입니다(재료 표 및 단계 1.6 참조).
- 조직의 무게를 잰다. 절편을 위해 파라핀을 삽입하는 경우 1.5단계를 계속합니다. 절편을 위해 저온 유지 물질 매립 매체에서 동결되는 경우 1.6단계를 계속합니다.
- 화학 물질 후드에서 조직을 10% 중성 완충 포르말린(NBF)(재료 표 참조)에 4°C에서 24시간 동안 담그고 PBS에서 각각 5분 동안 3회 세척합니다. 조직을 30% 자당에 48°C에서 48시간 동안 담그십시오.
- 이 조각이 제거되었으므로 조직의 무게를 잰다. 1.6단계를 계속 수행합니다.
- 화학 물질 후드에서 MFP 조각을 저온 유지 장치 임베딩 매체가 준비된 라벨이 부착된 카세트에 넣습니다. 조직을 덮기 위해 더 많은 저온 유지 물질 포매 매체를 추가합니다.
- 액체 질소로 사전 냉각된 2-메틸부탄(재료표 참조)의 비커에 카세트를 넣습니다. 비커는 바닥을 덮을 수 있을 만큼 충분한 2-메틸부탄을 가져야 하지만 저온 유지 물질 임베딩 매체가 2-메틸부탄에 닿지 않아야 하기 때문에 카세트를 잠길 만큼 충분하지 않아야 합니다. 저온 유지 물질 임베딩 매체가 얼어 불투명해질 때까지 카세트를 2-메틸부탄에 두십시오.
- 카세트를 호일로 감싸고 라벨을 붙인 다음 단면에 사용할 때까지 -80°C로 둡니다.
메모: 저온 유지 물질 포매 배지에 즉시 배치된 조직은 5μm에서 절편화하고, 자당에서 배양된 조직은 지방 세포 형태를 유지하기 위해 30μm에서 절편화했습니다.
- 집게를 사용하여 나머지 조직을 수동으로 마사지합니다.
메모: 조직 조각은 또한 24-48시간 동안 10% NBF에 배치하고 PBS에서 헹구고 파라핀에 삽입될 때까지 70% 에탄올에 남겨둘 수 있습니다. 임베딩 후, 5μm 절편을 헤마톡실린 및 에오신 (H & E) 염색에 사용할 수 있습니다 (아래 섹션 2 참조).
- MFP를 6mL 5% 트립신/0.02% EDTA 용액이 있는 0.05cm 접시에 넣습니다. 37 ° C에서 1 시간 동안 배양하십시오. 인큐베이터에 넣기 전에 접시에 70% 에탄올을 뿌리고 닦으십시오.
- 0.7mm 스트레이너를 사용하여 조직에 물을 세 번 부어 MFP를 탈이온수(DI)로 세척합니다. 집게를 사용하여 세척 사이에 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 적절한 크기의 교반 막대가 들어 있는 사전 오토클레이브 비커에 조직을 놓습니다. 조직 1g당 3% t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올 60mL(재료 표 참조)로 조직을 덮고 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 최소 20mL를 사용하십시오.
- 티슈와 내용물을 여과기에 버리십시오. 비커를 DI 워터로 헹구고 티슈에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 헹굼 사이에 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 티슈와 젓는 막대를 같은 비커에 다시 넣고 티슈 1g당 60mL의 4% 데옥시콜산으로 덮습니다. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다. 최소 20mL를 사용하십시오.
- 티슈와 내용물을 메쉬 스트레이너에 버리십시오. 비커를 DI 워터로 헹구고 티슈에 붓습니다. 두 번 더 반복합니다. 헹굼 사이에 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다.
- 같은 비커에 티슈를 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 신선한 DI 물과 함께 놓습니다. 파라핀 필름으로 단단히 덮으십시오. 4 °C에서 하룻밤 동안 그대로 두십시오.
- 다음 날 사용할 수 있도록 스트레이너와 비커를 세척하십시오.
- 2일차에는 비커 내용물을 여과기에 배출합니다. 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다.
- 적절한 크기의 교반 막대가 있는 동일한 비커에 MFP를 놓습니다. 조직 1g당 60mL 4% 에탄올/0.1% 과초산 용액으로 덮습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 2시간 동안 저어줍니다.
- 티슈와 내용물을 0.7mm 여과기에 넣습니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용물을 비커에 다시 넣습니다. 티슈 1g당 1x PBS 60mL로 조직을 덮어 씻습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 15분 동안 저어줍니다. 한 번 반복합니다.
- 티슈와 내용물을 0.7mm 여과기에 넣습니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오. 내용물을 비커에 다시 넣습니다. 티슈 1g당 60mL DI 워터로 티슈를 덮어 씻습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 15분 동안 저어줍니다. 한 번 반복합니다.
- 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 티슈와 내용물을 여과기에 버리십시오. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 내용물을 비커에 다시 넣습니다. 조직 1g당 60mL의 100% n-프로판올로 조직을 덮습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 1시간 동안 저어줍니다.
- 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 티슈와 내용물을 0.7mm 여과기에 넣습니다. 집게를 사용하여 조직을 수동으로 마사지하십시오.
- 내용물을 비커에 다시 넣습니다. 티슈 1g당 60mL의 DI 워터로 조직을 덮어 씻습니다. 최소 20mL를 사용하십시오. 실온에서 15분 동안 저어줍니다. 세 번 반복합니다.
- 티슈와 내용물을 여과기에 버리십시오. 2.3–2.6단계를 반복하여 저온 유지 물질 포매 배지에서 자당 배양 및 동결을 위한 조직 조각을 수집합니다.
- 섬세한 작업으로 조직을 잠시 말리고 닦고 무게를 잰다. 라벨이 붙은 15mL 튜브에 넣습니다. 밤새 -80 °C에서 얼립니다.