선암종 생착: 암세포를 쥐의 폐에 이식하는 방법

초록

출처: Stevens, L.E. et al, 블레오마이신으로 마우스의 기도를 사전 컨디셔닝하면 정형소 폐암 세포 생착의 효율성이 향상됩니다. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 섬유증 유발제인 블레오마이신(bleomycin)으로 기도를 사전 조정하여 쥐 폐에 폐 선암 세포를 생착시키는 방법을 설명합니다. 이 방법은 폐암 세포의 쥐 폐로의 이소소 생착을 크게 향상시킵니다

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 블레오마이신 치료

1. 종양 세포 생착 14일 전에 블레오마이신을 기관내 마우스에 주입할 계획입니다.
2. 주입 2시간 전에 얼음에 블레오마이신 스톡을 해동합니다.
3. 해동되면 블레오마이신을 원하는 작업 농도(0.02 U/50 μL 또는 0.005 U/50 μL)로 희석하고 얼음 위에 보관합니다.
   메모: 블레오마이신의 농도는 실험에 사용된 마우스 균주에 따라 다릅니다(표 1). 최적의 용량을 결정하기 위해 마우스에서 블레오마이신(bleomycin)을 적정해야 합니다.
4. 케타민과 자일라진을 각각 10mg/mL 및 1mg/mL의 최종 농도로 희석하여 마취를 준비하고, 1mL 주사기와 27G 바늘을 사용하여 각 마우스를 100/10mg/kg으로 복강내 케타민/자일라진 용액을 주입하여 각 마우스를 마취합니다.
5. 생쥐의 호흡을 모니터링하고 발가락 꼬집음을 사용합니다. 마우스가 발가락 꼬집음에 반응하지 않을 경우 적절한 마취를 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
6. 삽관 플랫폼에 한 번에 1마리의 마우스를 놓고 앞니를 플랫폼에 등을 대고 매달아 놓습니다.
7. 기관을 시각화하는 데 도움이 되는 광섬유 조명기를 사용하여 가슴 위쪽을 비춥니다. 마우스의 입을 벌리고 멸균된 편평한 집게로 혀를 부드럽게 당겨 빼냅니다.
8. 호흡이 막히지 않도록 바늘 없이 정맥 주사 카테터를 사용하십시오. 기관 개구부에서 방출되는 백색광 위에 카테터를 놓습니다.
9. 카테터 상단이 앞니에 닿을 때까지 카테터를 기관에 삽입합니다. 입안의 카테터 입구를 통해 비치는 백색광을 시각화하여 기관에 카테터가 제대로 배치되었는지 확인합니다.
10. 피펫을 사용하여 50μL의 블레오마이신 또는 비히클(PBS)을 카테터에 직접 분주하여 전체 부피가 흡입되도록 합니다. 멸균 상태에서 이 단계를 수행합니다.
11. 카테터가 올바르게 삽입되면 마우스는 즉시 카테터의 내용물을 흡입합니다. 전체 볼륨이 카테터를 따라 이동할 때까지 몇 초간 기다립니다. 그런 다음 기관에서 카테터를 제거하고 10% 표백제 용액에 폐기합니다.
    메모: 1.7-1.11 단계의 마우스당 평균 시간은 약 5분입니다.
12. 마우스가 액체를 흡입하지 않으면 호흡을 주의 깊게 모니터링하고 카테터 위치를 조정하십시오. 마우스가 호흡을 멈추면 즉시 카테터를 제거하고 카테터를 다시 삽입하기 전에 마우스가 정상적으로 호흡을 재개할 수 있도록 합니다.
13. 주입된 마우스를 IACUC에서 승인한 가열 패드에 올려 놓고 등을 대고 평평한 표면에 올려 놓고 회복합니다. 전체 절차는 마우스당 10분이 소요됩니다. 주사를 맞은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.
14. "사용 중인 유해 화학 물질" 카드를 케이지에 24시간 동안 놓습니다.

2. 폐 선암 세포주의 생착

참고: 블레오마이신 주입 후 14일 후에 세포 생착을 수행합니다(1.1단계).

1. 1.3.
   단계에 명시된 대로 해당 배지를 사용하여 주입일 전 3일 동안 방해받지 않고 75cm² 플라스크에서 세포가 성장하도록 합니다 메모: 주입 당일에 80%가 융합되어야 합니다(세포주에 따라 각 플라스크에서 2-3 x 10⁶에 해당).
2. 75cm² 플라스크에서 자라는 세포를 실온에서 5mL의 PBS로 세척합니다.
3. PBS를 흡인하고 세포에 1.5mL의 트립신을 첨가하고 세포가 분리될 때까지(일반적으로 2-5분) 37°C에서 세포를 배양합니다.
   메모: 플라스크 바닥을 간단하게 시각화하거나 광학 현미경으로 플라스틱에서 세포가 분리되었는지 2분마다 확인하는 것이 좋습니다. 트립신으로 5분을 초과하여 배양하지 마십시오.
4. 10% FBS가 포함된 배지 4mL를 추가하여 트립신을 중화합니다(단계 2.1과 동일한 배지). 세포를 15mL 튜브에 모으고 실온에서 3분 동안 200 x g으로 원심분리합니다.
5. 배지를 흡인하고 세포 펠릿을 PBS 5mL에 재현탁하여 세포를 세척합니다. 200 x g의 세포를 실온에서 3분 동안 펠릿 세포로 원심분리합니다. 이것을 1회 반복합니다.
6. PBS를 흡입하고 플라스크당 1.5mL의 PBS에 펠릿을 재현탁합니다.
7. 50μL의 세포 혼합물과 50μL의 트리판 블루를 혼합하고 세포 계수기/혈구 측정기 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.
8. PBS에서 세포를 희석하여 마우스당 50μL에 1 x 10⁵ 세포(또는 표시된 기타 양)를 주입하여 세포 현탁액을 준비합니다. 주입하기 전에 세포를 얼음 위에 두십시오.
   메모: 세포 현탁액이 고갈되지 않도록 주입을 위해 최소 2배 더 많은 세포를 준비합니다.
9. 케타민과 자일라진을 각각 10mg/mL 및 1mg/mL의 최종 농도로 희석하여 마취를 준비하고, 1mL 주사기와 27G 바늘을 사용하여 각 마우스에 각각 100/10mg/kg의 복강내 케타민/자일라진 용액을 주입하여 마취합니다.
10. 생쥐의 호흡을 모니터링하고 발가락 꼬집음을 사용합니다. 마우스가 발가락 꼬집음에 반응하지 않을 경우 적절한 마취를 확인하십시오. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
11. 삽관 플랫폼에 한 번에 1마리의 마우스를 놓고 앞니를 플랫폼에 등을 대고 매달아 놓습니다.
12. 기관을 시각화하는 데 도움이 되는 광섬유 조명기를 사용하여 가슴 위쪽을 비춥니다.
13. p200 피펫을 사용하여 세포가 뭉치지 않도록 부드럽게 재현탁합니다. 마우스의 입을 벌리고 멸균된 편평한 집게로 혀를 부드럽게 당겨 빼냅니다.
14. 호흡이 막히지 않도록 바늘을 제거한 상태에서 정맥 주사 카테터를 사용하십시오. 기관 개구부에서 방출되는 백색광 위에 카테터를 놓습니다.
15. 카테터 상단이 앞니에 닿을 때까지 카테터를 기관에 삽입합니다. 입안의 카테터 입구를 통해 비치는 백색광을 시각화하여 기관에 카테터가 제대로 배치되었는지 확인합니다.
16. 피펫을 사용하여 50μL의 세포를 카테터에 직접 분주하여 전체 부피를 흡입합니다. 멸균 상태에서 이 단계를 수행합니다.
    메모: 카테터가 올바르게 삽입되면 마우스는 즉시 카테터의 내용물을 흡입합니다.
17. 전체 부피가 카테터를 따라 이동할 때까지 몇 초간 기다린 다음 기관에서 카테터를 제거하고 10% 표백제 용액에 폐기합니다.
18. 마우스가 액체를 흡입하지 않으면 호흡을 주의 깊게 모니터링하고 카테터 위치를 조정하십시오. 마우스가 호흡을 멈추면 즉시 카테터를 제거하고 카테터를 다시 삽입하기 전에 마우스가 정상적으로 호흡을 재개할 때까지 기다립니다.
    메모: 2.11-2.18 단계의 마우스당 평균 시간은 약 5분입니다.
19. 복구를 위해 주입된 마우스를 IACUC에서 승인한 가열 패드에 올려 놓고 평평한 표면에 등을 대십시오.
    메모: 전체 절차는 마우스당 10분이 소요됩니다. 주사를 맞은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.
20. 이미징 전에 전기 면도기를 사용하여 B6129SF1/J 및 검은 털이 있는 다른 마우스 균주의 복부 및 등쪽 전체 갈비뼈 부위를 면도합니다.
21. 세포 주입 후 2-3분 후에 인슐린 바늘을 사용하여 100μL의 루시페린을 역궤도(15mg/mL)로 주입합니다. 모든 이미징 세션마다 주사에 사용되는 눈을 번갈아 가며 사용합니다.
22. 최소 2분 후, 최대 5마리의 마우스를 동물 생물 발광 이미저에 등쪽 누운 자세로 놓고 발광 설정을 사용하여 복부 사진을 획득합니다.
23. 제어판에서 해상도 및 감도 설정을 조정하여 주어진 세포주의 발광을 측정합니다. 대부분의 응용 프로그램의 경우 3분(또는 포화된 경우 "자동")으로 시작, binning=중간(4), f/stop=1, 시야각=D, 주제 높이=1.50.
    로 시작합니다. 메모: 주사가 성공하면 가슴 위쪽 부위, 한쪽 폐 또는 양쪽 폐에서 발광 신호가 감지됩니다.
24. 마우스를 흉골 누운 자세로 뒤집고 위와 같이 등쪽 사진을 얻습니다.
    메모: 세포 주입이 제대로 이루어지지 않으면 세포가 기관 입구나 목에 밀집될 수 있습니다.
25. 통증을 완화하기 위해 케토프로펜 5mg/kg을 복강내 주사합니다.
26. 마우스를 케이지로 다시 옮기고 케이지에 "BSL-2 Agent in Use" 카드를 놓습니다.
27. 삽관 직후 생쥐의 호흡 곤란을 모니터링하고, 그 다음에는 생쥐가 마취에서 깨어날 때까지 15분마다 모니터링합니다. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오.
28. 삽관 후 24시간 경과 일주일에 세 번 쥐를 검사하여 이환율의 징후가 있는지 확인합니다.
29. 시술 날짜, 동물 식별, 시술 유형, 마취 유형 및 수술 후 모니터링 관찰 및 시간을 일지에 기록하십시오.
30. 블레오마이신 접종 후 격주로 체중 감소, 호흡 곤란, 행동 이상 및 신체 상태 점수 <2(척추 뼈 분절/등쪽 골반 뼈가 만져짐)를 모니터링합니다.
    메모: 폐 종양이 있는 마우스는 호흡기 자극, 체중 감소, 악액질 및/또는 사망을 나타낼 수 있습니다.
31. 호흡 곤란에 시달리는 생쥐 또는 이산화탄소 또는 케타민/자일라진에 의해 체질량이 15% 감소한 후 조직을 채취하는 경우 자궁경부 탈구를 경험한 생쥐를 안락사시킵니다. 호흡기 활동을 위한 촉진을 실시하여 안락사를 확인합니다.

3. 생물발광 이미징을 통한 종양 성장 모니터링

1. 생착 후 3일째와 그 후 매주 마우스의 이미징을 반복합니다.
2. 케타민/자일라진(2.4-2.5단계에서 설명) 또는 이소플루란(2%)을 흡입하여 마우스를 마취합니다. 생쥐의 호흡을 모니터링하고 발가락 꼬집음을 사용하여 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조를 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
3. 영상 촬영 전에 전기 면도기를 사용하여 B6129SF1/J 및 검은 털이 있는 다른 마우스 균주의 복부 및 등쪽 전체 갈비뼈 부위를 면도합니다.
4. 마우스가 마취되면 인슐린 바늘을 사용하여 100μL의 루시페린을 역궤도(15mg/mL)로 주입합니다. 2분 동안 기다립니다. 모든 이미징 세션마다 주사에 사용되는 눈을 번갈아 가며 사용합니다.
5. 이미저에 마우스를 놓고 2.22-2.24단계에 설명된 대로 등쪽 및 복부 이미지를 획득합니다.
6. 이미징 후 회복을 위해 평평한 표면에 등을 대고 마우스를 케이지에 다시 넣습니다.
   메모: 전체 절차는 5 마리의 마우스 그룹당 5 분이 소요됩니다. 흉골 누운 상태를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 쥐를 방치하지 마십시오.
7. 이미저/생물 발광 분석 소프트웨어를 사용하여 이미지를 분석합니다.

결과

표 1: 테스트된 마우스 균주에 대한 블레오마이신의 권장 용량 목록.

마우스 변형	세포주	주입된 세포 수	% 생착		p 값
			차	블레오마이신
기분표기	H20...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
설치류 삽관 스탠드	브레인트리 사이언티픽	RIS-100	기관내 주사를 위한 권장 스탠드
블레오마이신	시그마	B5507-15UN	주의 : 건강 위험 GHS08
엑셀 카테터 24G	어부	1484121	바늘을 제거합니다. 기관내 주사용
케타민(케타셋 inl 100mg/mL, C3N, 10mL)	버틀러 샤인(Butler Schein)	56344	생쥐를 마취시키기 위해
자일라진	버틀러 샤인(Butler Schein)	33198	생쥐를 마취시키기 위해
주사기 1ml	BD / 피셔	Tel.: 14-823-434	복강내 주사용
Puralube 수의학 안과 연고	버틀러 동물 건강 회사 LLC	8897	마취 중 안구 건조를 예방하기 위해
MI-150 조명기 150W MI-150	돌란-제너 인더스트리	MI-150 / EEG2823M	기관을 비추고 시각화하기 위해
Graefe 집게, 2.75 (7cm) 긴 세라트	로보즈	RS-5111	기관내 주사용
플라스크 T/C 75cm sq canted neck, 블루 캡	피셔 / 코닝	353135
인산염 완충 식염수	생명 기술	14190-144
0.25% 트립신-EDTA	생명 기술	제25200-056
Pipet-Lite 피펫, unv. SL-200XLS+	메틀러 톨레도 국제공항	17014411
Countess 자동 세포 계수기	생명 기술	AMQAX1000
D-루시페린 파우더	퍼킨 엘머 건강 과학 Inc	122799	발광 이미징용. 15mg/mL의 작업 농도를 위해 PBS로 분말을 재구성합니다. 빛으로부터 보호
IVIS 스펙트럼 제노젠 생물 발광	퍼킨 엘머 건강 과학 Inc	124262	in vivo 생물 발광 이미징용
B6129SF1/J 마우스	잭슨 연구소	101043
NIH-H2030 세포	증권 시세	CRL-5914
PC9 셀	Nguyen, DX 외. Cell. 2009; 138:51–62
생생한 이미지 소프트웨어	퍼킨 엘머 건강 과학 Inc	128113	in vivo 생물 발광 분석용

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