$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. 3개의 독립적인 Afatinib 내성 PC-9 세포주 확립
- 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide(MTT) 분석을 사용하여 PC-9 세포에 대한 초기 afatinib 노출 농도 측정.
- 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 소 태아 혈청(10%), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)을 함유하는 성장 배지에서 PC-9 세포를 배양합니다.
- 성장 배지에서 PC-9 세포를 4 x 104 cells/mL로 재현탁한 다음 96웰 마이크로플레이트에서 50 μL/웰로 시딩합니다. 세포의 최종 농도는 2.0 x 103 cells/50 μL/well입니다. 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 하룻밤 동안 배양합니다.
- 성장 배지(50μL)가 포함된 웰에 0, 0.002, 0.006, 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, 6 및 20μM의 다양한 농도로 50μL의 아파티닙 용액을 추가합니다. 아파티닙의 최종 부피 및 농도는 각각 100μL 및 0, 0.001, 0.003, 0.01, 0.03, 0.1, 0.3, 1, 3 및 10μM입니다.
- 96-well 플레이트를 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 96시간 동안 배양합니다.
- 각 웰에 15 μL의 염료 용액(재료 표 참조)을 추가하고 37°C에서 5% CO2 인큐베이터에서 4시간 동안 배양한 다음 각 웰에 100 μL의 용해/정지 용액(재료 표 참조)을 추가하고 37°C의 5% CO2 인큐베이터에서 밤새 배양합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 570nm(OD570)에서 광학 밀도를 측정합니다(재료 표 참조). 6-12회 반복을 준비하고 실험을 최소 3회 반복합니다.
- 통계 소프트웨어(재료 표 참조)를 사용하여 이러한 데이터를 세미 로그 그래프로 그래픽으로 표시하고 반응을 최대 농도의 50%로 감소시키는 약물 농도인 IC50 값을 계산합니다(재료 표 참조).
- PC-9 세포를 비가역적 EGFR-TKI, afatinib에 3개의 독립적인 10cm 접시에서 단계적 용량 증량에 의해 지속적으로 노출
- PC-9 세포를 10mL의 성장 배지가 포함된 p100 접시에서 배양합니다. PC-9 세포가 sub-confluent 단계에 도달하면 1mL의 세포 현탁액을 9mL의 성장 배지와 함께 3개의 새로운 p100 접시로 옮깁니다. 1:10 희석된 PC-9 세포는 3-4일 내에 하위 결합이 되며 세포 수는 약 4-5 x 105 cells/mL입니다.
- 다음 날, IC50 값의 1/10을 3개의 p100 접시 각각에 추가합니다.
참고: Afatinib은 1 μM, 10 μM, 100 μM, 1 mM 및 5 mM의 재고 농도에서 DMSO에서 재구성됩니다. 1 - 10 μL의 afatinib 용액을 필요한 최종 농도에 따라 배양액 10 mL의 성장 배지에 첨가합니다.
- afatinib 함유 p100 접시의 세포가 sub-confluent 상태가 되면 1mL 피펫으로 흡인하여 잘 혼합하고 새 p100 접시에 있는 9mL의 신선한 성장 배지에 세포 현탁액 1mL를 추가합니다. 다음으로, 10-20% 더 높은 농도의 아파티닙을 새로운 배양액에 첨가합니다.
- 10-12개월 동안 각 단계에서 10-20%씩 증가된 아파티닙 농도와 함께 단계적 용량 증량에 의해 배지에서 0.1nM의 아파티닙 농도를 1μM로 증가시킵니다.
메모: 아파티닙 농도가 IC50 값에 접근하면 세포 성장이 상당히 느려집니다. 세포가 1:9로 분열되면 더 높은 농도의 아파티닙에 의해 사멸되기 때문에 성장하지 않을 수 있습니다. 따라서 더 높은 afanitib 농도에서 세포는 1:2의 비율로 분리될 수 있습니다. 가장 내성이 강한 세포는 아파티닙 함유 배지에서 3-14일 동안 성장시켰고, 내성 세포를 배양해야 할 때까지 배지를 변경하지 않았습니다.
- 1μM 아파티닙 함유 성장 배지에서 2-3개월 동안 아파티닙 내성 세포를 배양합니다. 1μM의 아파티닙 농도에서 이 모델에서 아파티닙에 대한 내성이 생기려면 10-12개월이 필요합니다. MTT 분석을 수행하여 세포가 afatinib에 내성이 있는지 확인합니다. 독립적으로 확립된 3개의 아파티닙 내성 세포주는 AFR1, AFR2 및 AFR3로 명명되었습니다.