Colony Formation Assay: Colony Forming Lung Cancer Cells에 대한 항암제의 효능 평가

초록

출처: Lee, J. Y.et al, 스페로이드, 군집 형성 분석 및 제브라피시 이종이식편에 의한 항암 쿠마린 OT48의 생체 활성에 대한 전임상 평가.J. Vis. 특급 (2018).

이 비디오는 폐암 세포가 무한정 증식하고 개별 군체를 형성하는 능력을 결정하는 데 도움이 되는 군집 형성 분석에 대해 설명합니다. 항암제가 군집 형성 세포에 미치는 영향은 결과 군체의 수 및/또는 크기의 변화를 분석하여 분석할 수 있습니다.

프로토콜

1. 콜로니 형성 분석

1. 37°C 및 5% CO₂ 인큐베이터에서 75cm² 플라스크에 10% FBS(Fetal Bovine Serum) 및 1% 항생제가 보충된 15mL의 RPMI1640세포 배양 배지에서 20,000 cells/^cm2 농도의 A549 세포를 배양합니다.
2. 실험 당일에는 혈구계를 사용하여 세포 농도를 측정합니다. 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에서 400 x g에서 7분 동안 원심분리를 통해 50,000개의 세포를 수집하고, 1.5 mL 튜브에서 100 μL의 1x sterile PBS(Phosphate Buffered Saline)에 세포를 재현탁합니다.
3. 멀티피펫을 사용하여 1.1mL의 반고체 메틸셀룰로오스 기반 배지(MCBM)를 15mL 튜브에 분주합니다. 각 조건에 대해 하나의 튜브를 준비합니다.
4. P200 마이크로피펫을 사용하여 110μL의 FBS를 1.1mL의 MCBM에 추가합니다.
5. 1,000 cells/mL에서 세포를 시딩합니다. P2 마이크로피펫을 사용하여 원액(1x PBS 100μL에 50,000개 세포)에서 2.4μL의 세포 현탁액을 수집하고 10% FBS가 보충된 1.1mL의 MCBM에 추가합니다.
6. 세포를 추가한 후 튜브를 1분 동안 소용돌이치고 MCBM과 세포가 잘 혼합되도록 최고 속도로 수직으로 유지합니다.
7. 테스트 화합물(OT48 단독 또는 A1210477과 조합)을 추가합니다. 사용된 용매(여기서는 디메틸 설폭사이드(DMSO))에 대한 대조군으로 별도의 튜브를 준비합니다. 화합물의 농도와 각 조건에 대해 첨가된 부피에 따라 용매 제어에는 용매로 인한 부작용을 평가하기 위해 테스트 화합물의 희석에 사용되는 가장 높은 농도의 용매가 포함됩니다.
8. 1분 동안 소용돌이 튜브.
9. 각 분석에 대해 P1000 마이크로피펫이 있는 혼합물 1mL를 12웰 세포 배양 플레이트의 중앙 웰에 추가합니다.
10. 습도를 안정화하기 위해 빈 웰에 1mL의 멸균수 또는 1x PBS를 채웁니다.
11. 배양 플레이트를 37°C 및 5% CO₂의 인큐베이터에서 10일 동안 배양
12. 배양 10일 후 MTT(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide) 원액 200μL를 각 웰에 첨가하여 최종 농도 1mg/mL에 도달합니다.
13. 37 ° C 및 5 % CO₂의 인큐베이터에서 10 분 동안 배양합니다. 생존 가능한 군체는 보라색으로 변합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
A549	증권 시세	CCL-185	섭씨 37도
RPMI 1640	론자	30096	섭씨 4도
FBS(증권 시세	바이오웨스트	S1520-500	-20°C
페니실린-스트렙토마이신	론자	17-602E	-20°C
세포 배양 플라스크 T75	증권 시세	70075	RT (RT
PBS 솔루션	하이클론	SH30256.02	RT (RT
1.5ml 튜브	엑스트라진	튜브 -170-C	RT (RT
15ml 튜브	현대마이크로	H20015	RT (RT
12웰 플레이트	증권 시세	30012	RT (RT
메토컬트	StemCell 기술	4230	-20°C
티아졸릴 블루 테트라졸륨 브로마이드(MTT 분말)	시그마	M5622	섭씨 4도
LAS4000	GE 헬스케어 테크놀로지		RT (RT

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