제브라피시 이종이식 분석법: 제브라피시 In Vivo의 종양원성에 대한 치료제의 항암 효능을 평가하는 방법

초록

출처: Lee, J. Y et al.,스페로이드, 군집 형성 분석 및 제브라피시 이종이식편에 의한 항암 쿠마린 OT48의 생체 활성에 대한 전임상 평가.J. Vis. 특급 (2018)

이 비디오는 생체 내 종양 형성을 평가하고 치료제의 효과를 연구하기 위한 제브라피시 이종 이식 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 제브라피시 이종 이식편 분석

참고: 이 기술적 접근 방식은 회로도로 시각화됩니다(그림 1).

1. 원료 시약의 제조
   1. 1740 mM NaCl, 21 mM KCl, 12 mM MgSO₄•7H2O, 18 mM Ca(NO₃)₂ 및 150 mM Hepes의 30x Danieau 용액 1L를 준비합니다. pH 측정기를 사용하여 버퍼의 pH를 7.6으로 조정합니다.
   2. 1%(50x) 트리카인 용액 준비: 증류수 2mL에 에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(트리카인) 20mg을 용해합니다.
   3. 1% 페놀 Red-PBS 용액 준비: 1.5μL 튜브에 198μL의 멸균된 PBS 용액에 2μL의 페놀 적색 나트륨 염 용액을 추가합니다.
   4. 3% 메틸셀룰로오스 준비: 1x Danieau's 용액 100mL에 메틸셀룰로오스 3g을 추가합니다.
2. 제브라피시 알 생산 및 부화
   1. 어둠 속에서 28.5°C의 자외선 살균 및 여과 수돗물로 채워진 칸막이 탱크에 암컷 제브라피시 한 마리와 수컷 제브라피시 한 마리를 분리합니다. 24시간 분리 후 두 성별의 물고기를 섞어 짝짓기를 시작합니다. 짝짓기 탱크에서 수정란을 신선한 Danieau's 용액 5mL가 들어 있는 페트리 접시로 옮깁니다.
   2. Danieau's 용액 5mL로 계란을 세 번 씻습니다. 세척을 위해 피펫으로 계란을 조심스럽게 흡인하고 5mL의 신선한 용액으로 옮깁니다. 28.5 °C에서 8 시간 동안 배양합니다.
      1. Danieau's solution에서 8시간 배양 후 색소 침착을 억제하기 위해 0.03% 1-phenyl-2-thiourea(PTU)를 함유한 Danieau's solution으로 변경합니다. 오염을 방지하기 위해 불투명한 난자(수정되지 않았거나 발달하지 않은 배아가 포함되어 있음)를 분류합니다.
3. 배아 탈환
   1. 24시간 수정후(HPF), 날카로운 집게를 사용하여 제브라피시 배아를 디코리온레이트합니다. Danieau의 용액에서 0.03% PTU로 28.5°C에서 48hpf까지 부화 배아를 배양합니다.
4. 화합물 처리된 세포 준비
   1. 25cm² 배양 플라스크에 20,000 cells/cm² 에서 A549 세포를 시드합니다. 파종 24 시간 후, 37 ° C 및 5 % CO₂의 인큐베이터에서 24 시간 동안 화합물 (여기서는 50 μM 및 / 또는 20 μM에서 A1210477 OT48)을 첨가하십시오.
   2. 세포의 생존력을 유지하되 세포가 사멸하도록 하기 위해 각 화합물에 대한 처리 시간을 설정합니다. 이 시점은 세포 생존율, 형태 및 분자 마커를 기반으로 개별적으로 설정해야 합니다.
   3. 처리가 끝나기 2 시간 전에 37 ° C 및 5 % CO₂에서 4 μM의 형광 세포 추적기 염료 CM-Dil로 세포를 염색합니다. 2시간 배양 후 0.05% 트립신-EDTA로 세포를 트립신화하고 주입 전에 50μL의 페놀 Red-PBS 용액에 106개의 세포를 희석합니다.
5. 이종이식 형성을 위한 암세포의 미세주입
   1. 제브라피쉬가 한천 플레이트에 정착할 때까지 0.02% 트리카인 용액에 제브라피쉬를 5분 동안 마취합니다.
   2. 마이크로피펫 풀러(프로그램 설정: P: 300, 가열: 260, 당기기: 60, VEL: 50, 시간: 200)로 1.0mm(외경(OD) 유리 모세관)를 당깁니다. 주사기로 미세 모세관을 잘라 날카로운 모서리를 만듭니다. 20μL의 cell/phenol Red-PBS 용액으로 마이크로 모세관을 로드합니다. 주입 압력과 주입 당 2nL를 분배하도록 시간을 설정합니다.
   3. 3-5회 주사를 통해 6-10nL를 주사하여 100-200개의 세포를 난황낭에 주입합니다. 주입 후 물고기가 PTU 용액이 함유된 신선한 Danieau's 용액 5mL에서 10-30분 동안 회복되도록 합니다. PTU 용액이 함유된 Danieau's 용액 1mL와 함께 24웰 플레이트에 물고기를 넣고 28.5°C에서 72시간 동안 배양합니다.
   4. 72시간의 배양 후 0.02% 트리카인 용액으로 물고기를 마취하고 3% 메틸셀룰로오스 한 방울로 유리 슬라이드에 고정시킵니다. 620 - 750 nm의 파장에서 형광 현미경으로 5배 사진을 촬영합니다.
   5. ImageJ 소프트웨어를 통한 형광 종양의 크기 정량화. 메뉴 "Analyze(분석) | 측정". 형광 신호에 해당하는 값을 저장하고 그래픽 표현을 위해 통계 소프트웨어로 분석합니다.

결과

그림 1: 제브라피시 이종이식 분석의 전체 과정에 대한 개략도.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
A549	증권 시세	CCL-185	섭씨 37도
RPMI 1640	론자	30096	섭씨 4도
FBS(증권 시세	바이오웨스트	S1520-500	-20°C
페니실린-스트렙토마이신	론자	17-602E	-20°C
세포 배양 플라스크 T25	증권 시세	70025	RT (RT
세포 배양 플라스크 T75	증권 시세	70075	RT (RT
세포 배양 플라스크 T175	증권 시세	71175	RT (RT
1.5ml 튜브	엑스트라진	튜브 -170-C	RT (RT
24웰 플레이트	증권 시세	제30024	RT (RT
페트리디쉬	증권 시세	10100	RT (RT
PBS 솔루션	하이클론	SH30256.02	RT (RT
트립신-EDTA	지브코	Tel.: 25-300-054	섭씨 4도
소금	시그마-알드리치	71382	RT (RT
염화칼륨(KCL)	시그마-알드리치	P9541	RT (RT
황산마그네슘 헵타하이드레이트(MgSO4.7H2O)	시그마-알드리치	M2773	RT (RT
질산칼슘 사수화물(Ca(NO3)2)	시그마-알드리치	C1396 (영문	RT (RT
HEPES 솔루션	시그마-알드리치	H0887	RT (RT
에틸 3-아미노벤조에이트 메탄설포네이트(트리카인)	시그마-알드리치	E10521	RT (RT
페놀 레드 용액	시그마-알드리치	P0290	RT (RT
메틸셀룰로오스	시그마-알드리치	M0512	RT (RT
1-페닐-2-티오우레아(PTU)	시그마-알드리치	P7629	RT (RT
CM-딜 염료	인비트로젠	C7001	-20°C
유리 모세관	세계적인 정밀 기기	TW 100F-4	RT (RT
마이크로피펫 풀러	셔터 기기, 미국	P-97	RT (RT
마이크로 인젝터	세계적인 정밀 기기	PV820	RT (RT
주사기	코백스	1ml	RT (RT
마이크로 로더	에펜도르프	5242956003	RT (RT
유리 슬라이드	마리엔펠트	HSU-1000612	RT (RT
형광 현미경 검사	라이카	독일/DM 5000B	RT (RT

표시기 년 표시기 시리즈 표시기 ) 표시기 ) 표시기 ) ) 표시기 조 ) 표시기 년 ) ) ) (영문) ) ) ) ) ) ) ) ) (영문) ) ) ) ) ) ) ) )