출처: Chang, J. E., et al. 폐암 표적 나노 입자를 이용한 광역학 요법의 항암 효능.J. Vis. 특급(2016).
광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 비침습적 비수술적 방법입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다. 이 프로토콜 비디오에서는 PDT 기반 방법을 사용하여 폐암 세포에서 잠재적인 광감작제의 광독성 가능성을 평가합니다.
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방법 논문
체외 광독성 분석법: 폐암 세포에서 광감작제의 광독성 가능성을 평가하기 위한 PDT 기반 방법
3.9K 조회수
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2023년 4월 30일
이 논문에서
초록
프로토콜
1. 히알루론산-세라마이드(HACE)의 합성
- 히알루론산(HA) 올리고머 12.21mmol과 테트라-n-부틸암모늄하이드록사이드(TBA) 9.77mmol을 이중 증류수(DDW) 60ml에 용해시킵니다. 30분 동안 저어줍니다.
- DS-Y30 링커를 합성하려면 DS-Y30 세라미드 8.59mmol과 트리에틸아민 9.45mmol을 테트라하이드로푸란(THF) 25ml에 용해시킵니다. THF에 8.59mmol의 4-클로로메틸벤조일 클로라이드와 혼합합니다. 60 ° C에서 6 시간 동안 저어줍니다.
- 합성된 8.10mmol의 HA-TBA와 0.41mmol의 DS-Y30 링커를 THF와 아세토니트릴(4:1, v/v)의 혼합물에 용해시킵니다. 40 °C에서 5 시간 동안 저어줍니다.
- 필터제로 여과하여 불순물을 제거하고, 진공 증발로 유기용제를 제거합니다. 투석막(분자량 기준: 3.5kDa)을 사용하여 제품을 정제하고 동결건조합니다.
2. 나노 입자의 제조
- HB 1mg과 파클리탁셀 1mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 0.5ml에 녹이고 0.5ml의 DDW와 5분 동안 와류 혼합으로 혼합합니다. 그런 다음 5분 더 동안 와류 혼합에 의해 해당 혼합물에 HACE를 용해시킵니다.
- 용매를 제거하려면 질소 가스의 부드러운 흐름에서 70 ° C에서 4 시간 동안 가열하십시오.
- HACE, HB 및 파클리탁셀로 구성된 필름을 DDW 1ml로 재현탁합니다. 주사기 필터(0.45μm 기공 크기)로 필터링하여 캡슐화되지 않은 약물을 제거합니다.
3. 체외 광독성
- 폐암 세포주에서 나노입자 흡수
- RPMI-1640 배지 함유 10%(v/v) 소 태아 혈청과 1%(w/v) 페니실린-스트렙토마이신을 준비합니다.
- 24웰 세포 배양 플레이트에 1 × 105개 세포/웰의 밀도로 A549 세포를 시드합니다(각 그룹당 3회). 37 ° C에서 24 시간 동안 가습 된 5 % CO2 및 95 % 공기 대기에서 배양합니다.
- 세포 부착 후 배지를 제거하고 인산염 완충 식염수(PBS) 1ml를 첨가하여 세포를 세척합니다.
- PBS의 나노 입자를 최종 농도 2μM/ml HB로 용해시킵니다. 그런 다음 어둠 속에서 4시간 동안 각 웰에 1ml의 PBS, 빈 NP, HB-NP 또는 HB-P-NP로 세포를 배양합니다.
- 용액을 모두 제거하고 차가운 PBS 1ml를 첨가하여 세포를 세척합니다. 세탁 단계를 한 번 더 반복합니다. 신선한 배양 배지를 추가하십시오.
- 세포 생존율 분석
- 세포 배양 플레이트를 PDT 섬유 아래에 놓습니다(PDT 섬유에서 웰까지 1cm 거리). 레이저 보안경을 착용하고 어둠 속에서 PDT 레이저(630nm, 400mW/cm2)로 0, 5, 10, 20, 30, 40초(0, 2, 4, 8, 12, 16J/cm2)의 다양한 시간 동안 셀을 비춥니다. 그런 다음 어둠 속에서 24시간 동안 세포를 배양합니다.
- 배지를 흡인하고 차가운 PBS 1ml를 첨가하여 세포를 세척합니다. 세탁 단계를 한 번 더 반복합니다.
- 각 웰에 10μl의 세포독성 측정 용액을 추가합니다. 어둠 속에서 2시간 동안 배양합니다.
- 마이크로플레이트 리더를 사용하여 450nm에서 흡광도를 측정합니다.
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공개 사항
선언된 이해 상충이 없습니다.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 올리고 히알루론산 | 공급자:Bioland Co., Ltd. | ||
| DS-Y30 (세라마이드 3B, 주로 Noleoyl-phytosphingosine) | Doosan Biotech Co., Ltd. (두산바이오텍) | ||
| 아디프산 디히드라지드 | 시그마 알드리치 | A0638 | |
| N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드 | 시그마 알드리치 | 39391 | |
| 4- (클로로 메틸) 벤조일 클로라이드 | 시그마 알드리치 | 270784 | |
| 파클리탁셀 | 타이화 기업 | ||
| 주사기 필터 | 싸토리우스 스테딤 생명공학 GmbH | 17762 | 15mm, RC, PP, 0.45μm |
| RPMI-1640 | Gibco 생명 기술, Inc. | 11875 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco 생명 기술, Inc. | 15070 | |
| 소 태아 세럼 | Gibco 생명 기술, Inc. | 16140071 | |
| Celite (필터 에이전트) | 시그마 알드리치 | 6858 | 1.4단계를 참조하십시오. |
