PDT의 생체 내 항종양 효능 분석: 종양 보유 마우스에서 광감작제의 광독성 가능성을 측정하는 기술

초록

출처: Chang, J. E., et al. 폐암 표적 나노 입자를 사용한 광역학 치료의 항암 효능. J. Vis. 특급 (2016).

광역학 요법(PDT)은 폐암 치료를 위한 비침습적 비수술적 방법입니다. 광감작제는 종양 조직에 선택적으로 축적되어 산소와 적절한 파장의 빛이 있는 상태에서 종양 세포를 사멸시킵니다. 이 비디오는 종양이 있는 마우스에서 나노입자를 함유한 광감작제를 사용하여 광감작제의 광독성 가능성을 측정하기 위한 생체 내 항종양 효능 분석에 대해 설명합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 히알루론산-세라마이드(HACE)의 합성

1. 히알루론산(HA) 올리고머 12.21mmol과 테트라-n-부틸암모늄하이드록사이드(TBA) 9.77mmol을 이중 증류수(DDW) 60ml에 용해시킵니다. 30분 동안 저어줍니다.
2. DS-Y30 링커를 합성하려면 DS-Y30 세라미드 8.59mmol과 트리에틸아민 9.45mmol을 테트라하이드로푸란(THF) 25ml에 용해시킵니다. THF에 8.59mmol의 4-클로로메틸벤조일 클로라이드와 혼합합니다. 60 ° C에서 6 시간 동안 저어줍니다.
3. 합성된 8.10mmol의 HA-TBA와 0.41mmol의 DS-Y30 링커를 THF와 아세토니트릴(4:1, v/v)의 혼합물에 용해시킵니다. 40 °C에서 5 시간 동안 저어줍니다.
4. 필터제로 여과하여 불순물을 제거하고, 진공 증발로 유기용제를 제거합니다. 투석막(분자량 기준: 3.5kDa)을 사용하여 제품을 정제하고 동결건조합니다.

2. 나노 입자의 제조

1. HB 1mg과 파클리탁셀 1mg을 디메틸설폭사이드(DMSO) 0.5ml에 녹이고 0.5ml의 DDW와 5분 동안 와류 혼합으로 혼합합니다. 그런 다음 5분 더 동안 와류 혼합에 의해 해당 혼합물에 HACE를 용해시킵니다.
2. 용매를 제거하려면 질소 가스의 부드러운 흐름에서 70 ° C에서 4 시간 동안 가열하십시오.
3. HACE, HB 및 파클리탁셀로 구성된 필름을 DDW 1ml로 재현탁합니다. 주사기 필터(0.45μm 기공 크기)로 필터링하여 캡슐화되지 않은 약물을 제거합니다.

3. 종양 보유 마우스의 생체 내 항암 효능

1. 폐암에 의한 마우스 모델
   1. 0.1 ml RPMI-1640 배지에 1 ×^{10 6} A549 셀을 준비하고 얼음에 보관하십시오.
   2. 자일라진(xylazine)과 틸레타민(tiletamine)과 졸라제팜(zolazepam)의 혼합물(1:2, 1 ml/kg)을 i.p. 주사로 마우스에 마취시킵니다. 마우스 피부의 작은 접힌 부분을 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
      메모: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 실험을 시작할 수 있을 만큼 충분히 마취됩니다.
   3. BALB/C 수컷 누드 마우스(6-7주, 20-22g)의 왼쪽 측면에 세포를 피하로 주입합니다.
   4. 쥐가 우리 주위를 움직이기 시작할 때까지 계속 관찰합니다.
      메모: 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오. 마우스를 특정 병원체가 없는(SPF) 조건에서 유지하십시오.
   5. 매일 캘리퍼로 종양 크기를 측정하십시오. 종양 부피(mm³)를 (길이 × 너비²) / 2로 계산합니다. 종양 크기가 약 200mm³ 부피에 도달하면 실험을 시작합니다.
2. 항암 효능 연구
   1. 마우스를 4개의 그룹으로 무작위로 나눕니다(각 그룹당 n = 10).
   2. 자일라진(xylazine)과 틸레타민(tiletamine)과 졸라제팜(zolazepam)의 혼합물(1:2, 1 ml/kg)을 i.p. 주사로 마우스에 마취시킵니다. 마우스 피부의 작은 접힌 부분을 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
      메모: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 실험을 시작할 수 있을 만큼 충분히 마취됩니다.
   3. PBS의 나노 입자를 최종 농도 2mg/ml HB로 용해시킵니다. 꼬리 정맥(HB로 2mg/kg)을 통해 PBS, free HBS, HB-NP 또는 HB-P-NP를 0일과 7일에 두 번 주입합니다.
   4. 쥐가 우리 주위를 움직이기 시작할 때까지 계속 관찰합니다.
      메모: 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오. 케이지를 어둡게 유지하고 특정 SPF 조건에서 유지하십시오.
   5. 각 주사 후 24시간 후에 자일라진과 틸레타민 및 졸라제팜(1:2, 1ml/kg)의 혼합물을 IP(i.p.) 주사로 마우스에 마취시킵니다. 마우스 피부의 작은 접힌 부분을 부드럽게 꼬집어 적절한 마취를 확인합니다. 마취 상태에서 건조함을 방지하기 위해 수의사 연고를 눈에 바르십시오.
      메모: 움직임이 관찰되지 않으면 동물은 실험을 시작할 수 있을 만큼 충분히 마취됩니다.
   6. 종양 부위를 PDT 섬유 아래에 놓습니다(PDT 섬유에서 종양까지의 거리 1cm). 레이저 보안경을 착용하고 스위치를 끈 다음 1일차와 8일차에 두 번 PDT 레이저(630 nm, 400 mW/cm²)로 500초(200 J/cm²) 동안 종양을 비춥니다.
   7. 쥐가 우리 주위를 움직이기 시작할 때까지 계속 관찰하십시오. 동물이 흉골 누운 자세를 유지할 수 있을 만큼 충분한 의식을 회복할 때까지 동물을 방치하지 마십시오. 수술을 받은 동물이 완전히 회복될 때까지 다른 동물과 함께 돌려보내지 마십시오.
   8. 케이지를 SPF 조건으로 유지하십시오. 레이저 치료 후 24시간 동안 케이지를 어두운 곳에 보관하십시오.
   9. 매일 종양 부피와 종양 부위의 변화를 육안으로 모니터링합니다. 캘리퍼스로 종양 크기를 측정하고 부피를 (길이 × 너비²) / 2 (mm³)로 계산합니다. PDT 후 종양 표면 변화를 확인하기 위해 매일 종양 부위 사진을 찍습니다.
   10. 16일째에는 그룹당 5마리의 마우스를 이소플루란을 사용한 말단 마취로 희생시킵니다.
   11. 집게와 가위로 바깥쪽 피부를 자르고 종양을 노출시킵니다. 조심스럽게 수확하십시오. 10% 포르말린으로 고정하고 파라핀에 삽입한 다음 조직학적 분석을 위해 헤마톡실린과 에오신(H&E)으로 염색합니다.
   12. 45일간의 모니터링 후, 이소플루란을 사용한 말기 마취로 나머지 마우스를 희생시킵니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
올리고 히알루론산	공급자:Bioland Co., Ltd.
DS-Y30 (세라마이드 3B, 주로 Noleoyl-phytosphingosine)	Doosan Biotech Co., Ltd. (두산바이오텍)
아디프산 디히드라지드	시그마 알드리치	A0638
N-(3-디메틸아미노프로필)-N'-에틸카르보디이미드	시그마 알드리치	39391
4- (클로로 메틸) 벤조일 클로라이드	시그마 알드리치	270784
파클리탁셀	타이화 기업
주사기 필터	싸토리우스 스테딤 생명공학 GmbH	17762	15mm, RC, PP, 0.45μm
RPMI-1640	Gibco 생명 기술, Inc.	11875
페니실린-스트렙토마이신	Gibco 생명 기술, Inc.	15070
소 태아 세럼	Gibco 생명 기술, Inc.	16140071
Celite (필터 에이전트)	시그마 알드리치	6858	1.4단계를 참조하십시오.