폐 주입 및 고정: 기관에 액체를 주입하고 폐를 고정하여 고정된 폐 용적을 측정합니다.

초록

출처: Limjunyawong, N. et al, 마우스 폐암 연구에 유용한 주입 및 고정 방법. J. Vis. 특급. (2015).

이 비디오는 폐 점안, 고정 및 폐 용적 측정을 위해 기관에 액체를 주입하는 간단하고 신뢰할 수 있는 방법을 설명합니다.

프로토콜

동물과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 폐 점안

1. 삽관에 사용할 시판되는 1인치 길이의 20g 정맥 캐뉼라를 선택하십시오.
2. 카테터 팁을 수동으로 수정하여 그림 1과 같이 팁에 약간의 곡률을 생성하도록 구부립니다.
3. 주입된 IP를 케타민(100mg/kg)과 자일라진(15mg/kg)의 혼합물로 마우스에 마취하고 반사 동작이 없는 상태에서 마취를 확인합니다. 마취 직후 즉시 눈에 동물용 연고를 바르십시오. 마취 직후 눈에 동물용 연고를 바르고 수술 후 및 점안 진통제를 위해 카프로펜(5-10mg/kg SQ)을 투여합니다.
4. 마우스를 비스듬한 플랫폼에 누운 상태로 놓습니다. 그림 2에서 볼 수 있듯이 봉합사 루프가 테이프로 붙인 대형 사무용 바인더는 완벽하게 작동합니다.
5. 목의 복부 부분을 면도하고 70% 알코올로 목 부위를 청소하고 소독합니다.라텍스와 파우더가 없는 새 장갑을 끼고 70% 알코올로 소독된 수술 기구를 사용하십시오.
6. 날카로운 가위를 사용하여 아래 앞니 아래 약 12mm 떨어진 곳에 작은 외과적 절개를 만듭니다.
7. 겸자로 기관의 복벽이 보일 때까지 목의 피부를 꼬리 쪽으로 부드럽게 당깁니다.
8. 혀를 부드럽게 집어넣고 구부러진 끝이 마우스의 복부 표면 쪽으로 기울어진 상태에서 캐뉼라를 삽입합니다. 1.4에서와 같이 목 피부를 부드럽게 당기고 캐뉼라를 기관에 삽입합니다.
   메모: 조금만 연습하면 카테터가 기관 아래로 이동하는 것을 볼 수 있습니다. 식도로 들어가면 카테터의 움직임을 시각적으로 볼 수 없습니다. 기관을 절개하지 않습니다.
9. 카테터가 목의 기관에서 보이면 성대를 안정적으로 통과할 수 있도록 약 5mm 전진시키지만 여전히 카리나보다 훨씬 위에 있습니다.
10. 젤 로딩 피펫 팁으로 카테터를 통해 주입하여 최대 50μl의 액체를 주입할 준비를 합니다. 팁을 루어 허브에 놓되 주입하기 전에 마우스의 호흡과 동기화된 팁의 유체 움직임을 주의 깊게 관찰하십시오. 그런 다음 주입하십시오.
11. 1ml 주사기를 사용하여 즉시 카테터를 통해 0.6ml의 공기를 폐로 비교적 빠르게 팽창시켜 액체를 폐 깊숙이 분배하는 데 도움을 줍니다. 캐뉼러를 제거합니다.
12. 캐뉼러를 제거합니다.
13. VetBond의 패키지 삽입 지침에 따라 소량의 시아노아크릴레이트 접착제를 사용하여 작은 수술 상처를 봉합합니다. 생쥐를 개별 케이지에 넣고 생쥐가 깨어나 불편한 기색 없이 정상적으로 행동할 때까지 육안으로 모니터링합니다.

2. 고정 폐 용적 측정

1. 그림 3과 같이 아르키메데스 원리를 사용하여 폐 용적을 측정합니다. 포름알데히드에서 고정된 폐를 제거하고 심장 및 기타 폐가 아닌 조직을 해부합니다.
2. 폐를 물 속에 완전히 담그는 데 사용되는 이전에 제작된 간단한 수제 와이어 지지 장치를 사용하십시오.
   메모: 이 장치는 사용 중인 저울과 호환되어야 합니다. 그림 4에 표시된 일반적인 장치는 플라스틱 피펫과 얇은(20G) 와이어로 만들어집니다. 이 시스템은 비디오에 사용된 저울과 잘 작동하지만 대부분의 실험실 저울에 쉽게 적용할 수 있습니다.
3. ≈200ml의 물이 담긴 비커를 저울에 놓고 지지 케이지가 물 속에 있는 상태에서 용기를 싣습니다. 그림 5를 참조하십시오. 금속 케이지를 제거하십시오. 폐를 물 표면에 놓고 케이지로 물 아래를 누릅니다.
4. 저울에 무게를 기록하십시오. 이 숫자는 치환된 물의 양을 반영하므로 폐 부피를 직접 측정합니다. 폐나 봉합사 또는 와이어 케이지의 어떤 부분도 비커의 측면이나 바닥에 닿지 않도록 주의하십시오.
5. 정확도를 위해 이 측정을 반복하십시오. 물에서 폐를 제거하고 티슈로 말리십시오. 케이지가 제자리에 있는 비커의 무게를 다시 측정하고 폐 용적 측정을 반복합니다. 그런 다음 두 부피 측정의 평균을 구해야 합니다.
   메모: 폐가 포르말린에 약 일주일 이상 남아 있으면 폐의 공기가 액체에 용해됩니다. 이런 일이 발생하면 폐가 가라앉기 때문에 폐를 물에 잠긴 상태로 유지하기 위해 그림 4와 같은 장치를 더 이상 사용할 필요가 없습니다. 이러한 경우 그림 3과 같이 폐가 완전히 잠길 때까지 봉합사 줄 중 하나로 폐를 잡고 부피를 측정할 수 있습니다.

결과

그림 1: 점안을 위해 팁이 약간 구부러진 정맥 카테터.

그림 2: 삽관을 위해 마우스를 지지하는 데 사용되는 경사진 3링 바인더. 이 바인더는 3 마리의 마우스를 담을 수 있도록 설정되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
실험실 저울	오하우스	어드벤쳐 프로 모델 AV 313	범위가 1-300g인 경우 다른 저울을 사용할 수 있습니다
Luer 정맥 카테터 20g	인실테		다른 여러 가능한 공급업체(예: Jelco Optiva)
500ml 실험실 병	다양한		다른 여러 가능한 공급 업체