방법 논문

저주파 초음파 응용 분야 : 인간 백혈병 세포에 대한 초음파 처리의 효과를 결정하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Trendowski, M. et al. 처리되지 않은 세포와 처리된 종양 세포의 음향 감도를 결정하기 위한 펄스 저주파 초음파의 생성 및 정량 분석. J. Vis. 특급 (2015).

이 비디오는 저주파 초음파를 사용하여 인간 백혈병 세포의 선택적 손상을 설명합니다. 전임상 시험관 내 조건에서 저주파 초음파를 적용하는 것은 백혈병과 정상 세포에 대한 초음파 처리의 효과를 조사하고 비교하기 위해 세포 파괴를 달성 할 수 있음을 보여줍니다.

프로토콜

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1. 세포 및 배지의 준비

  1. 240ml Iscove의 IMDM(Modified Dubecco's Medium)과 50ml 소 태아 혈청을 사용하여 배지를 준비합니다. 소의 태아 혈청을 뜨거운 물로 해동하지 마십시오., 급격한 온도 상승은 혈청 안정성의 저하로 이어질 수 있습니다. 표준 배양 플라스크에 240μl 겐타마이신 50mg/ml와 5ml 페니실린/스트렙토마이신 100x를 결합하고 배지에 추가합니다. 매체를 4°C에서 보관하십시오.
  2. 준비된 배지를 사용하여 25cm2 플라스크에 ~4 x 104 cells/ml로 U937 세포를 시딩합니다. 15-20 μl의 세포와 15-20 μl의 트리판 블루를 마이크로 원심분리 튜브에 넣고 내용물을 혼합하여 TC20 세포 계수기 및 트리판 블루 배제를 사용하여 세포의 농도와 생존율을 평가합니다. 이 혼합물을 피펫15-20 μl를 TC20 샘플링 슬라이드에 넣고 슬라이드를 TC20 셀 카운터에 배치하여 계수를 시작합니다.
  3. 37°C 및 5% CO2에서 세포를 배양하고 트리판 블루 배제 및 TC20 세포 계수기를 사용하여 세포 생존력을 확인합니다. 세포가 적절한 농도에 도달하거나 적절한 시간 동안 초음파 감응제로 처리된 경우, 배양 플라스크에서 3ml의 세포를 20ml 유리 섬광 바이알로 옮깁니다. 이 프로토콜에서 U937 세포를 48 시간 동안 성장시킨 다음 30 분 동안 0.5, 1 또는 5 mM MeβCD로 처리하여 초음파 처리 전에 세포의 콜레스테롤을 충분히 고갈시킵니다.

2. 세포 초음파 처리

  1. 진공 청소기와 Buchner 플라스크를 사용하여 탈기된 증류수를 탈기합니다. 물을 컵 혼으로 옮기고 혼 상단에서 15mm 높이까지 채웁니다. 초음파 처리 과정은 몇 분 동안 물의 추가 탈기를 유발하며, 샘플 초음파 처리 전에 시스템을 실행하지 않으면 실험 과정에서 불일치가 발생할 수 있습니다. 따라서 샘플 초음파 처리 전에 ~7분 동안 시스템을 실행하십시오.
  2. 세포가 들어 있는 섬광 바이알을 고정 장치에 부착합니다. 그런 다음 고정 장치를 컵 혼 상단에 부착하고 혼 상단에서 15mm 높이로 설정합니다(슬라이딩 메커니즘을 사용하여 수면에서).
  3. 세포는 일반적으로 3 개의 1 초 초음파를 사용하여 초음파 처리되며, 이러한 각 펄스 사이에 1 초의 간격이 있습니다. 이 프로토콜의 경우, 위에서 언급한 펄스 투여를 사용하여 33% 및 50% 진폭으로 세포를 초음파 처리합니다.

3. 초음파 처리 후 손상에 대한 세포 평가

  1. trypan blue와 TC20 세포 계수기를 사용하여 부유 세포의 손상 및 생존력을 평가합니다. 또한 Z2 카운터를 사용하여 샘플을 분석합니다. Z2 카운터 분석의 경우, 100μl 세포 현탁액을 20ml 등장성 식염수(200:1 비율)에 피펫으로 주입합니다. 분석하기 전에 등장성 식염수를 사용하여 Z2 입자 분석기의 조리개를 두 번 이상 세척합니다. Z2 샘플을 카운터 홀더에 놓고 계수를 시작하기 전에 플랫폼을 조리개까지 올립니다.
  2. 제조업체에서 제공하는 소프트웨어를 사용하여 TC20 및 Z2 카운터에서 데이터를 수집합니다. 세포 손상, 생존력 및 초음파 처리로 인한 세포 파편 생성에 대해 이러한 데이터를 분석합니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Iscove의 변형 Dulbecco의 배지 w/ NaHCO3 & 25mM Hepes생명 기술12440079
소 태아 세럼시그마-알드리치12105
겐타마이신 50mg/ml시그마-알드리치G1397
페니실린/스트렙토마이신 100x 용액생명 기술제10378-016
Bio-Rad TC20 자동 세포 계수기바이오 라드Tel.: 145-0102
Trypan 블루 솔루션시그마-알드리치T8154
Falcon 50 ml & 25 ml 통풍 문화 플라스크피셔 사이언티픽353082
100 μl 마이크로피펫휘튼851164
1,000 μl 마이크로피펫휘튼851168
U937 인간 단핵구 백혈병 세포증권 시세CRL1593.2
THP1 인간 단핵구 백혈병 세포증권 시세TIB-202
Branson SLPe 40kHz 셀 디스럽터(3인치(25mm) 컵혼Branson 초음파Tel.: 101-063-726초음파 처리 장치
Beckman-Coulter Z2 셀 사이저(AccuComp® 소프트웨어벡크만-쿨터6605700
Seal-Rite 1.5ml 마이크로 원심분리기 튜브미국 과학1615-5510
Beckman-Coulter Accuvette ST 25 ml 바이알 및 캡벡크만-쿨터A35473
AccuJet Pro 자동 피펫브랜드테크 사이언티픽26330
USA Scientific 10ml 일회용 혈청학 피펫미국 과학제1071-0810
Tip One 100 μl 및 1,000 μl 필터 팁미국 과학1120-1840년, 1126-7810
BioRad 듀얼 챔버 카운팅 슬라이드바이오 라드Tel.: 145-0015
20ml 유리 섬광 바이알시그마-알드리치Z190527
Wheaton 250ml 플라스크시그마-알드리치Z364827
년 호 표시기 표시기 포함) 포함) 년 호 년

재인쇄 및 허가

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태그

Z2

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