XTT Assay: 세포 생존율 및 미토콘드리아 활성을 평가하기 위한 비색 분석

초록

Trendowski, M., et al. 처리되지 않은 및 처리된 종양 세포의 음향 감도를 결정하기 위한 펄스 저주파 초음파의 생성 및 정량 분석. J. Vis. 특급 (2015)

이 기사에서는 세포 생존율과 미토콘드리아 활성을 평가하기 위한 비색 분석인 XTT 분석의 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 처리된 U937 및 THP1 세포의 세포 생존율 및 미토콘드리아 활성을 결정하기 위한 XTT 분석

1. XTT 분석 전에 동일한 조건에서 U937 및 THP1 세포를 성장시킵니다. 초음파 처리 전에 30분 동안 MeβCD와 동일한 농도 범위의 세포를 전처리합니다. XTT 키트가 평가할 손상 범위를 개발하기 위해 1초 간격으로 1-3개의 1초 펄스 범위를 사용하여 세포가 초음파 처리된다는 점을 제외하고 이전과 동일한 초음파 매개변수를 사용합니다.
   메모: 이러한 단계 중 다수는 XTT 키트 설명서에서 직접 발췌한 것이며 관심 있는 실험실의 편의를 위해서만 반복됩니다.
2. 200 x g에서 10분 동안 원심분리하여 세포를 수집합니다. 앞서 설명한 성장 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다. ~1 x 10⁵ cells/ml에서 세포를 재현탁합니다. U937 세포를 웰당 100μl로 평평한 바닥 96웰 마이크로타이터 플레이트에 3회 시딩한 다음 별도의 96웰 플레이트를 사용하여 THP1 세포에 대해 반복합니다. 100μl의 완전한 성장 매체를 블랭크 흡광도 판독값으로 단독으로 포함하는 3개의 제어 웰을 포함합니다. 그런 다음 접종된 플레이트를 24시간 동안 배양합니다.
3. 사용하기 전에 XTT 시약과 활성화 시약의 두 부분 표본을 37°C에서 해동합니다. 맑은 용액을 얻을 때까지 부드럽게 소용돌이치며 분취합니다. 0.1ml의 활성화 시약을 XTT 시약 5.0ml에 첨가하면 96웰 마이크로타이터 플레이트 분석 1회에 충분한 활성 XTT 용액을 형성할 수 있습니다. 다른 플레이트에 대해서도 이 과정을 반복합니다.
4. 각 웰에 50μl의 activate-XTT 용액을 추가합니다. 플레이트를 세포 배양 CO₂ 인큐베이터에 2시간 동안 다시 넣습니다. 배양 기간에 따라 플레이트를 부드럽게 흔들어 양극 웰에 주황색을 고르게 분포시킵니다. microtiter 플레이트 리더를 사용하여 450-500nm 파장 사이의 파장에서 세포와 빈 배경 제어 웰을 포함하는 assay well의 흡광도를 측정합니다.
5. 블랭크 컨트롤 웰을 사용하여 마이크로타이터 플레이트 리더를 0으로 만들거나 특정 결과에서 평균값을 뺍니다. 630-690nm 사이의 파장에서 모든 분석 웰의 흡광도를 다시 측정하고 얻은 450-500nm 값에서 값을 뺍니다. 참고: 이 두 번째 흡광도 측정은 분석 결과에서 비특이적 판독값을 제거하는 데 도움이 됩니다. XTT 분석은 두 세포주에 대해 4회 반복되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
이스코베의 개조된 둘베코의 미디엄 NaHCO3 및 25mM 헤페스 포함	생명 기술	12440079
Branson SLPe 40kHz 셀 디스럽터( 포함) 3"(25mm) 컵혼	Branson 초음파	Tel.: 101-063-726	초음파 처리 장치
Tip One 100 μl 및 1,000 μl 필터 팁	미국 과학	1120-1840년, 1126-7810
100 μl 마이크로피펫	휘튼	851164
1000 μl 마이크로피펫	휘튼	851168
Forma Scientific 이중 챔버 물 재킷 인큐베이터	포마 사이언티픽	3131
XTT 세포 증식 분석 키트	증권 시세	30-1011케이
96-Well 마이크로플레이트 리더	콜-파머	EW-13055-54
U937 인간 단핵구 백혈병 세포	증권 시세	CRL1593.2
THP1 인간 단핵구 백혈병 세포	증권 시세	TIB-202

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