BrdU 면역형광 염색: 세포 주기의 여러 단계에서 세포를 식별하는 기술

초록

출처: Welschinger, R., et al. 동기화 없이 유세포 분석을 사용하여 세포 주기 진행의 시간적 추적. J. Vis. 특급 (2015).

이 동영상은 BrdU 면역형광 염색 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술을 사용하면 세포주기의 여러 단계에서 세포를 식별 할 수 있습니다. DNA 염료 및 항체 표지를 추가하면 나중에 S기 세포의 운명을 자세히 분석할 수 있습니다.

프로토콜

1. 솔루션 및 시약

1. 완전한 RPMI
   1. 56ml의 송아지 혈청(FCS)과 5.5ml의 200mM L-글루타민을 RPMI-1640 배지 500ml 병에 추가합니다.
2. DNase 솔루션
   1. DPBS로 1mg DNase/ml를 준비합니다.
3. 염색 완충액
   1. DPBS에서 3% 열 불활성화 FCS와 0.09% 아지드화나트륨을 준비합니다.
4. Fixation Buffer, Permeabilization Buffer 및 Wash Buffer의 정의는 Materials List를 참조하십시오.

2. 세포 염색

참고: 세포의 표면 염색이 필요한 경우 고정 전에 이를 수행하여 세포가 전체적으로 4°C로 유지되도록 합니다.

1. 100 μl의 염색 완충액에 세포를 재현탁시킵니다(선택적 표면 염색의 경우, 권장 부피의 항체를 표면 항원에 추가하고 4 °C에서 30분 동안 배양).
2. 염색 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 버립니다.
   메모: 특정 항체, 농도, 배양 시간 등은 특정 실험 목표에 따라 달라집니다.
3. 정착 및 투과
   1. 100μl의 고정 완충액에 세포를 재현탁하고 실온에서 15분 동안 배양합니다.
   2. 세척 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
   3. 100μl의 투과화 완충액에 세포를 재현탁시키고 얼음 위에서 10분 동안 세포를 배양합니다.
   4. 세척 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
   5. 튜브당 100μl의 고정 완충액에 세포를 재현탁시키고 실온에서 5분 동안 배양합니다.
   6. 세척 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상등액을 버립니다.
      참고: 필요한 경우 여기에서 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 고정된 세포는 염색 완충액에 재현탁하는 경우 4°C에서 며칠 동안 안정적입니다. 계속하기 전에 원심분리 후 염색 완충액을 제거합니다.
4. DNase 처리
   1. 100μl의 DNase 용액(30μg의 DNase/10⁶개 세포)에 세포를 재현탁하고 37°C에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
   2. 세척 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
5. 항체 염색
   참고: BrdU 이외의 세포 내 마커에 대한 염색은 BrdU 염색과 동시에 수행할 수 있습니다.
   1. 중요: 염색되지 않은 세포와 각 단일 형광 색소로 표지된 세포로 구성된 보상 대조군을 준비합니다. 이상적으로는 실험 튜브에 사용된 것과 동일한 항체를 보상 제어에 사용하는 것이 좋습니다. 그러나 이것이 가능하지 않은 경우 동일한 형광 색소에 접합된 고도로 발현된 항원에 항체를 대체하십시오.
   2. 50 μl의 세척 완충액에 세포를 재현탁시키고 1 μl/10⁶ 세포의 BrdU 항체를 추가합니다.
      참고: 다른 특정 세포 내 항원에 직접 접합된 항체를 추가할 수도 있습니다.
      메모: Ser10에서 인산화된 히스톤 H3에 대한 항체는 G2와 M의 세포를 구별하는 데 사용할 수 있으며, 히스톤 H3는 유사분열 동안 Ser10에서 인산화됩니다. Tyr15에서 인산화된 cdc2에 대한 항체는 유사분열을 일으킨 세포를 검출하는 데 사용할 수 있습니다.
   3. 실온에서 20분 동안 세포를 배양합니다.
   4. 세척 완충액 1ml를 넣고 150 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리한 후 상층액을 버립니다.

6. 세포 주기 분석을 위한 DNA 염색
   1. 펠릿을 풀고 20 μl의 7-AAD 용액 (0.25 μg)을 첨가합니다 .
      참고: 일정한 양의 7-AAD/셀을 사용하는 것이 중요합니다.
   2. 염색 완충액 1ml에 세포를 재현탁합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
APC BrdU 플로우 키트	BD 바이오사이언스	552598	BrdU 항체, 7-AAD 및 BD Cytofix/Cytoperm Buffer(Fixation Buffer라고 함) 포함
BD 펌/워시 버퍼	BD 바이오사이언스	554723	세척 버퍼라고 합니다.
BD Pharmingen 얼룩 완충제	BD 바이오사이언스	554656
피펫맨	길슨	P2, P20, P100, P1000
DNase	시그마	D-4513
BD Cytoperm 투과화 완충액 플러스	BD 바이오사이언스	561651	투과화 버퍼라고 합니다
원심 분리기	스핀트론	GT-175R
AF488 anti-Histone H3 Phospho (Ser10) 항체	세포 신호 전달	9708년대
Phospho-Chk2 (Thr68) (C13C1) 토끼 mAb	세포 신호 전달	2197초
Phospho-Chk1 (Ser345) (133D3) 토끼 mAb	세포 신호 전달	2348초
BD Falcon 12 x 75mm FACS 튜브	BD 바이오사이언스	352008

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