백혈병 세포와 BMSC의 2D 공동 배양: 백혈병 세포의 하위 집단을 얻는 방법

초록

출처: Slone, W. L. et al. Modeling Chemotherapy Resistant Leukemia In Vitro. J. Vis. Exp. (2016).

이 비디오는 백혈병 세포와 골수 기질 세포의 장기 2D 공동 배양 기술을 설명하여 골수 미세환경과의 상호 작용을 연구합니다. 2D 공동 배양 모델은 종양 세포 표현형에 영향을 미치는 급성 림프모구 백혈병 세포와 골수 기질 또는 조골세포를 활용합니다. 이 연구는 화학 요법에 노출되는 동안 백혈병 세포의 생존을 지원하는 골수의 기초가 되는 메커니즘에 대한 조사를 지원할 것입니다.

프로토콜

1. 고급 준비

1. 골수 기질 세포(BMSC) 및 조골세포(OB) 배양.
   1. BMSC 또는 OB를 37°C에서 6% CO₂로 유지하고 90% 포화도에 도달할 때까지 10cm 조직 배양 플레이트에서 성장합니다.
   2. BMSC 또는 OB 세포를 트립신화하고 새로운 10cm 플레이트에 1:2로 분할합니다. 세포는 백혈병 공동 배양에 필요할 때까지 이러한 표준으로 성장합니다.

2. 공동 문화의 확립 및 유지

1. 10ml의 종양 특이적 배양 배지에 있는 5-20 x 10⁶개의 백혈병 세포를 80%-90% 융합 BMSC 또는 OB 플레이트에 추가합니다.
   참고: 우리 실험실은 1%에서 7% 범위인 골수 미세환경을 더 잘 재현하기 위해 37°C에서 5% O₂에서 공동 배양을 유지합니다. 그러나 이러한 산소 장력에서 공동 배양을 유지하는 것은 3개의 백혈병 하위 집단을 확립하는 데 중요하지 않으며 실험실의 재량에 달려 있습니다.
2. 4^일마다 1ml의 배지(현탁액의 백혈병 세포 포함)를 제외한 모든 배지를 제거하고 9ml의 새로운 백혈병 배양 배지로 교체하십시오. 플레이트에서 9ml의 배지를 제거할 때 골수 기질 세포(BMSC) 또는 조골세포(OB) 부착층을 방해하지 않도록 주의하십시오.
   1. 플레이트를 옆으로 기울여 미디어를 제거하고 플레이트 모서리에 있는 미디어를 흡인합니다. 또한 새 매체를 추가할 때 BMSC 또는 OB 접착 층의 중단을 최소화하기 위해 측벽에 대한 플레이트 모서리에 드롭 와이즈를 추가해야 합니다.
3. 공동 배양 12 일 후, 접시의 배양 배지를 약 5-10 회 접시 위아래로 부드럽게 피펫으로 엿 넣어 BMSC 또는 OB 층의 백혈병 세포를 헹군 다음 15ml 원뿔형 튜브에 모으십시오. 2.1.
   단계에 설명된 대로 새로운 80%-90% confluent BMSC 또는 OB 플레이트에 다시 시드합니다. 참고: 2.3단계에서 설명한 대로 공동 배양을 부드럽게 헹구면 BMSC 또는 OB 단층을 방해하지 않고 부유 및 위상 밝은 백혈병 세포를 제거할 수 있습니다. 이를 통해 종양 세포만 다음 공동 배양 플레이트로 전달할 수 있습니다. 이 12일 주기는 사용자 필요에 따라 필요한 만큼 반복할 수 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
100 x 20mm 세포 배양 접시	Greiner 바이오 원	664160
15ml 원뿔형 원심분리기 튜브	월드 와이드 의료 제품	41021037	세포 채취에 사용
문화 미디어
골아세포 배양 배지	프로모셀	C-27001	인간 조골세포 배지용
RPMI 1640 미디어	미디어테크, Inc.	제15-040	종양 배지 준비용
부착 세포
인간 조골세포	프로모셀	C-12720	인간 조골세포는 공급자의 권고에 따라 배양하였다.
인간의 뼈 Morrow 기질 세포	WVU 생체 표본 코어		비식별화된 원발성 인간 백혈병 및 골수 기질 세포(BMSC)는 Mary Babb Randolph Cancer Center(MBRCC) Biospecimen Processing Core 및 West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank에서 제공했습니다
백혈병 세포
레(REH)	증권 시세	ATCC-CRL-8286	REH 세포는 공급자의 권장 사항 및 권장 배지에 따라 배양되었습니다.
SD-1	디에스엠즈	ACC 366	SD-1은 공급업체의 권장 사항 및 권장 배지에 따라 배양되었습니다.

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