Leukemic Subpopulation Harvest: 2D 공동 배양에서 백혈병 세포 하위 집단의 공간적 분리 방법

초록

출처: Slone, W. L., et al. 체외 화학요법 저항성 백혈병 모델링. J. Vis. Exp. (2016).

이 비디오는 3개의 백혈병 세포 하위 집단, 즉 배지에서 자유롭게 떠다니는 부유 백혈병 세포, 중간엽 기질 세포 단층의 표면에 부착된 위상 밝은 백혈병 세포, 2D 공동 배양에서 중간엽 기질 세포 단층 아래로 이동한 위상 희미한 백혈병 세포의 공간 분리 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 공동 문화 내에서 3 개의 하위 집단 분리

1. 현탁액(S) 종양 하위 집단의 수집.
   1. 피펫을 사용하여 공동 배양 플레이트의 배지를 흡입하고 동일한 배지를 부드럽게 다시 적용하여 플레이트를 헹구고 15ml 원뿔형 튜브에 백혈병 세포가 포함된 배지를 수집합니다. 수집된 백혈병 세포는 S 하위 집단입니다.
2. Phase Bright (PB) 종양 하위 집단 수집.
   1. 10ml의 신선한 배지를 공동 배양 플레이트에 다시 추가합니다. 부착된 백혈병 세포를 제거하기 위해 추가된 배지를 약 5회 위아래로 피펫팅하여 세게 헹굽니다.
   2. 피펫으로 흡입하고 15ml 원뿔형 튜브에 매체를 수집합니다. 수집된 세포는 PB 하위 집단입니다.
3. Phase Dim(PD) 종양 하위 집단의 수집.
   1. 플레이트를 1ml PBS로 헹궈 남아 있는 매체를 제거합니다. 3ml 트립신과 함께 공동 배양 플레이트를 트립신화하고 37°C 인큐베이터에 5분 동안 넣습니다.
   2. 인큐베이터에서 플레이트를 제거하고 플레이트의 측면을 부드럽게 두드려 부착된 BMSC/OB를 제거합니다.
   3. 1ml의 소 태아 혈청(FBS)과 피펫을 위아래로 3-5회 첨가하여 큰 세포 응집체를 분해합니다.
   4. 15ml 원뿔형 튜브에 세포가 있는 배지를 수집합니다. 이 세포는 BMSC/OB가 있는 정제되지 않은 PD 하위 집단입니다.
4. 400 x g에서 7분 동안 3개의 분리된 하위 집단을 원심분리기합니다. 상층액을 흡입하고 폐기한 다음 1ml의 예열 배지에 펠릿을 개별적으로 재현탁합니다. 셀을 G10 열에 로드할 준비가 되었습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
50ml 원추형 원심분리기 튜브	월드 와이드 의료 제품	41021039	방부제 솔루션 세포학 표본
15ml 원뿔형 원심분리기 튜브	노바시트	해당 없음	세포 채취에 사용
소 태아 세럼	시그마	F6178
0.05% 트립신	미디어텍, Inc	5229 텍 5	25-053-CI
100 x 20mm 세포 배양 접시	Greiner 바이오 원	664160
문화 미디어
골아세포 배양 배지	프로모셀	C-27001	인간 조골세포 배지용
RPMI 1640 미디어	미디어테크, Inc.	제15-040	종양 배지 준비용
세포주
인간 조골세포	프로모셀	C-12720	인간 조골세포는 공급자의 권고에 따라 배양하였다.
인간의 뼈 Morrow 기질 세포	WVU 생체 표본 코어		비식별화된 원발성 인간 백혈병 및 골수 기질 세포(BMSC)는 Mary Babb Randolph Cancer Center(MBRCC) 생체 표본 처리 코어 및 West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank에서 제공했습니다. BMSC 배양은 앞서 설명한 바와 같이 확립되었습니다(*)
백혈병 세포
레(REH)	증권 시세	ATCC-CRL-8286	REH 세포는 공급자의 권장 사항 및 권장 배지에 따라 배양되었습니다.
SD-1	디에스엠즈	ACC 366	SD-1은 공급업체의 권장 사항 및 권장 배지에 따라 배양되었습니다.

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