G-10 컬럼 기반 백혈병 세포 분류: 골수 기질 세포에서 급성 림프구 백혈병 세포를 정제하는 방법

Abstract

출처: Slone, W. L.,et al. 체외 화학 요법 저항성 백혈병 모델링. J. Vis. Exp. (2016).

이 동영상은 겔 타입 10 가교 덱스트란 G-10 컬럼을 사용하여 골수 기질 세포에서 급성 림프구 백혈병 세포를 분리하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 부착된 골수 기질 세포 아래로 이동한 종양 세포 집단을 복구하여 "위상 희미한" 종양 세포 집단을 생성하는 데 도움이 됩니다.

Protocol

1. G10 컬럼에 공동 배양 세포 로딩

참고: G10 열에 셀이 포함된 미디어를 추가하기 전에 스톱콕이 완전히 닫혀 있는지 확인하십시오. 또한 다운스트림 분석에서 모집단 간에 편향이 발생하지 않도록 각 하위 모집단을 별도의 G10 열에 걸쳐 실행해야 합니다.

1. 1,000μl 피펫을 사용하여 예열된 배지의 각 세포 subpopulation을 1ml를 별도의 G10 컬럼에 적하 방향으로 추가합니다. 세포를 포함하는 매체가 G10 펠릿 상단 또는 내에 남아 있는지 확인합니다. 세포가 RT.
   에서 20분 동안 G10 펠릿에서 배양하도록 합니다. 메모: 마개는 부화 기간 동안 닫혀 있습니다.

2. G10 Column에서 백혈병 세포 수집

1. 각 G10 컬럼에 1-3ml의 예열 매체를 추가합니다. 스톱콕 밸브를 열고 매체가 컬럼에서 천천히 드롭 방향으로 빠져나오도록 합니다.
   메모: 컬럼에서 느린 유속을 유지하는 것이 중요하며, 그렇지 않으면 BMSC/OB가 포함된 G10 펠릿이 컬럼에서 씻겨 나와 분리된 백혈병 세포를 오염시킬 수 있습니다.
2. 총 15-20ml가 컬럼을 통과하고 수집될 때까지 예열된 매체를 G10 컬럼에 조금씩(1-2ml) 계속 추가합니다. 마개 밸브와 캡 수집 튜브를 닫습니다.
   메모: 수집 튜브 바닥에 G10 입자 펠릿이 보이면 튜브에서 매체를 부드럽게 제거하고 G10 입자 펠릿을 그대로 두고 새 튜브로 옮깁니다.
3. RT에서 7분 동안 400 x g에서 여과액을 원심분리기로 수집했습니다. 상등액을 제거하고 세포 펠릿을 다운스트림 응용 분야에 적합한 완충액에 재현탁합니다.
4. 세포는 이제 BMSC 또는 OB 오염이 없는 순수한 백혈병 세포 집단이며 사용자 재량에 따라 다운스트림 응용 분야에 적용할 준비가 되었습니다.
   참고: 백혈병 세포 생존력은 세포가 G10 컬럼을 통과할 때 변하지 않아야 합니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
G10 세파덱스 비즈	시그마	G10120	원고에서는 gel type 10 cross-linked dextran particles로 지칭
10ml 멸균 주사기	BD (영어)	309604
1방향 스톱콕	월드 정밀 기기, Inc.	14054-10
인간 조골세포	프로모셀	C-12720	인간 조골세포는 공급자의 권고에 따라 배양하였다.
인간의 뼈 Morrow 기질 세포	WVU 생체 표본 코어		비식별화된 원발성 인간 백혈병 및 골수 기질 세포(BMSC)는 Mary Babb Randolph Cancer Center(MBRCC) 생체 표본 처리 코어 및 West Virginia University Department of Pathology Tissue Bank에서 제공했습니다. BMSC 배양은 앞서 설명한 바와 같이 확립되었습니다(*)
0.05% 트립신	미디어테크, Inc.	25-053-CI
레(REH)	증권 시세	ATCC-CRL-8286	REH 세포는 공급자의 권장 사항 및 권장 배지에 따라 배양되었습니다.
유리솜	파이렉스	3950
50ml 원추형 원심분리기 튜브	월드 와이드 의료 제품	41021039	수집 튜브로 사용
15ml 원뿔형 원심분리기 튜브	월드 와이드 의료 제품	41021037	세포 채취에 사용
소 태아 세럼	시그마	F6178
SD-1	디에스엠즈	ACC 366	SD-1은 공급업체의 권장 사항 및 권장 배지에 따라 배양되었습니다.
100 x 20mm 세포 배양 접시	Greiner 바이오 원	664160