Retro-Orbital Blood Sampling: A Method for Isolating Mononuclear Cells from the Retro-Orbital Sinus of a Mouse(역안와 혈액 샘플링: 마우스의 후안와 부비동에서 단핵 세포를 분리하는 방법)

초록

출처: Mopin A. et al. 쥐 C1498 세포주 및 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화하기 위한 상세 프로토콜. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 쥐의 후안와동에서 말초 혈액을 채취하는 샘플링 방법과 밀도 구배 원심분리를 통해 혈액에서 단핵 세포를 추가로 분리하는 방법을 설명합니다.

프로토콜

1. 레트로 안와 혈액 수집

1. 안락사 직전에 멸균 상태에서 층류 후드와 난방 램프 아래에서 저체온증을 예방하기 위해 역순 안와 혈액 채취를 수행합니다.
2. 마취를 위해 케타민은 150mg/kg, 자일라진은 10mg/kg을 사용하십시오. PBS 용액 1.5ml에 케타민 1.5ml와 자일라진 0.5ml를 희석하여 마취액을 준비합니다.
3. 눈의 내측 안각에 모세혈관을 삽입합니다. 혈액은 안와동에서 모세혈관으로 올라갑니다. 멸균 거즈 스펀지로 눈에 부드럽게 압력을 가하여 출혈을 조절합니다.
   메모: 이 기술을 사용하여 100-200μl의 혈액을 수집할 수 있습니다.
4. 혈액을 EDTA 튜브에 모으고 단핵 세포를 분리하기 전에 샘플을 얼음 위에 보관하십시오.

2. 혈액 단핵 세포의 분리

1. 혈액 샘플(100-200μl, 1.1단계에서 얻은 것)을 마이크로 원심분리 튜브로 옮기고 용액 부피가 500μl가 될 때까지 PBS/1mM EDTA 용액을 추가합니다. 30G 바늘과 1ml 주사기를 사용하여 혈액이 포함된 용액 아래에 500μl의 분리 용액을 조심스럽게 겹겹이 쌓습니다. 혈액과 분리 용액을 혼합하지 마십시오.
2. RT에서 20분 동안 800 x g(브레이크 제외)에서 튜브를 원심분리합니다. 원심분리 후 피펫을 사용하여 세포 고리(불투명한 흰색 층)를 수집합니다. 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   메모: 불투명한 흰색 층은 림프구와 단핵구를 포함하며 분리 용액인 하층과 상층 사이에 나타납니다.
3. PBS 용액 1ml를 넣고 350 x g에서 10분 동안 튜브를 원심분리하고 600μl의 FACS 완충액에 세포를 재현탁합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
케타민 1000 (100 mg/ml)	버박	3.59713E+12
자일라진 세닥실란(20mg/ml)	세바
PBS 용액(농축액 1개)	써모피셔 사이언티픽	14190
초순수 0.5 M EDTA 용액, pH 8.0	써모피셔 사이언티픽	15575
분리 용액(Pancoll Mouse)	(주)팬바이오텍	전화04-64100
EDTA 튜브	Greiner 바이오 원	454034
파스퇴르 피펫 150mm(모세관)	피셔브랜드	제1154-6963
유세포 분석 튜브(파란색)	벡크만 쿨터	2523749
마이크로 원심분리기 튜브(1.5ml)	써모피셔 사이언티픽	전화: 05-408-129
멸균 거즈 스펀지	우르고	501580
30G 바늘	벡턴 & 디킨슨	304000
주사기 1ml	테루모	친위대-01T
Shandon Cytospin 3 세포원심분리기	써모피셔 사이언티픽