방법 논문

May-Grunwald Giemsa 염색: 골수 세포를 염색하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Mopin, A. et al. 쥐 C1498 세포주 및 관련 백혈병 마우스 모델을 특성화하기 위한 상세 프로토콜. J. Vis. 특급 (2016).

이 비디오는 May-Grünwald Giemsa 염색을 사용하여 골수 세포를 염색하는 기술에 대해 설명합니다. 프로토콜에서는 쥐 골수성 백혈병 세포인 C149 세포를 염색하여 형태 및 차등 계수를 분석합니다.

프로토콜

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1. C1498 세포주의 체외 특성화

  1. C1498 세포의 체외 배양
    1. 500ml의 RPMI 배지에 50ml의 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100 U/ml)-스트렙토마이신(100 μg/ml) 5ml, 500 μl의 50 mM β-메르캅토에탄올, N-2-하이드록시에틸피페라진-N-2-에탄술폰산(HEPES) 5 ml, 비필수 아미노산 5 ml 및 피루브산 나트륨 5 mL를 첨가하여 완전한 RPMI(Roswell Park Memorial Institute) 1640 배지를 준비합니다.
    2. C1498 세포주를 완전한 RPMI로 성장시킵니다. 피펫팅으로 현탁액 세포를 채취하고 세포를 50ml 튜브로 옮깁니다. 350 x g에서 10분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 제거합니다.
    3. 인산염 완충 식염수(PBS)(1x) 용액 20ml를 넣고 350 x g에서 10분 동안 원심분리한 후 상층액을 제거합니다.
    4. 10ml의 FAC(Fluorescence-Activated Cell Sorter) 완충액(500ml의 PBS 용액에 2.5g의 소 혈청 알부민(BSA) 분말과 2ml의 0.5M 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 용액)에 세포를 재현탁합니다. 세포를 trypan blue로 염색한 후 Thoma 세포 계수 챔버를 사용하여 세포를 계수합니다.

2. 현미경 검사를 위한 슬라이드의 세포 현탁액 준비

  1. 수확된 C1498 세포 106개(단계 1.1.4에서 얻음)를 5ml의 저온 FAC 완충액으로 2회 세척하고 세포를 1ml의 저온 FAC 완충액으로 희석합니다. 튜브를 얼음 위에 놓습니다.
  2. 필터 카드가 미리 부착된 일회용 챔버에 슬라이드를 넣고 세포 원심분리기에 넣습니다.
  3. 각 챔버와 필터 카드에 100μl의 FAC 버퍼를 추가하고 4.52 x g에서 2분 동안 회전시킵니다.
  4. 각 챔버와 필터 카드에 100μl의 세포를 추가하고 4.52 x g에서 2분 동안 셀을 회전시킵니다.
  5. 챔버에서 슬라이드를 조심스럽게 제거하고 슬라이드를 자연 건조시킨 후 May-Grünwald Giemsa 염색으로 염색합니다.

3. May-Grünwald Giemsa (MGG) 염색

  1. May-Grünwald 용액이 들어 있는 Coplin jar에 슬라이드를 3분 동안 담궈 세포(섹션 2에서 준비)를 염색합니다.
  2. pH 6.8 완충 용액이 들어 있는 Coplin 용기에 슬라이드를 1분 동안 옮깁니다.
  3. Giemsa R 용액(pH 1 완충 용액에서 20/6.8으로 희석)이 들어 있는 Coplin 항아리에 슬라이드를 넣어 10분 동안 슬라이드를 염색합니다. 슬라이드를 중성수(pH 7)로 10초 동안 세척합니다.
  4. 슬라이드를 배수하고 자연 건조합니다. 장착 매체 2 한 방울을 셀에 적용하여 슬라이드를 장착합니다. 커버 유리의 한쪽 가장자리를 슬라이드에 놓고 집게를 사용하여 셀 위로 조심스럽게 내립니다. 커버 유리를 부드럽게 눌러 기포를 제거합니다.

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공개 사항

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선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
C1498 세포주 증권 시세팁 49
2-메르캅토에탄올, Gibco 써모피셔 사이언티픽21985
소 태아 세럼(FBS) 써모피셔 사이언티픽10270
HEPES, Gibco (1M) 써모피셔 사이언티픽15630
페니실린-스트렙토마이신, Gibco 써모피셔 사이언티픽15140
RPMI 1640 배지 (Gibco, GlutaMAX 보충제) 써모피셔 사이언티픽61870
트리판 블루 용액 (0.4 %) 써모피셔 사이언티픽제15250-061농도 1/2
챔버 & 필터 카드 (EZ Cytofunnel Shandon) 써모 사이언티픽(Thermo ScientificA78710003
May-Grünwald 솔루션 RAL 진단 프로그램제320070
Giemsa R 솔루션 RAL 진단 프로그램320310농도 1/20
pH 6.8 완충 용액 RAL 진단 프로그램330368
슬라이드(Starfrost - 접지 가장자리 90) 니트텔 글라스VS1137# 077FKB
현미경 커버 안경, 24 x 24mm 니트텔 글라스VD1 2424 Y100
Shandon Cytospin 3 세포원심분리기 써모피셔 사이언티픽
표시기 년 년 년 년 년 호 ) 호

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pH 6 8Giemsa RFACS

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