밀도 구배 원심분리법: 말초 혈액에서 CLL 세포를 분리하는 방법

Abstract

출처: Hay, J. et al. 핵/세포질 단백질 이동을 모니터링하기 위한 원발성 만성 림프구성 백혈병 세포의 세포 내 분획. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 말초 혈액에서 만성 림프구성 백혈병(CLL) 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜을 통해 인간 환자의 혈액 샘플에서 CLL 세포를 분리하여 핵 및 세포질 분획을 효율적으로 생성할 수 있습니다.

Protocol

1. 환자의 혈액 샘플에서 CLL 세포 분리

1. 이전에 동의한 CLL 환자의 말초 혈액 샘플은 백혈구 수(WCC)와 함께 EDTA 혈액 수집 튜브에 넣어 클리닉에서 받습니다. WCC에 따라 말초 혈액 CLL 샘플을 정제합니다. WCC < 40 x 10⁶ cells/mL의 경우 1.1.1단계로 진행합니다. WCC ≥ 40 x 10⁶ cells/mL의 경우 1.1.2단계로 진행합니다.
   1. 모든 EDTA 혈액 튜브의 내용물을 50mL 원뿔형 원심분리 튜브에 붓고 혈액 1mL당 50μL의 인간 B 세포 농축 칵테일을 추가합니다. 실온(RT)에서 20분 동안 배양합니다. 1.1.2단계로 진행합니다.
   2. RT CLL 세척 완충액(인산염 완충 식염수(PBS), 0.5% 소 태아 혈청(FBS) 및 2mM EDTA)로 샘플을 1:1 비율로 희석합니다.
2. RT 밀도 구배 매체를 시료를 위한 적절한 크기의 원뿔형 원심분리 튜브에 분배합니다(30mL 시료의 경우 50mL 튜브에 10mL, 10mL 시료의 경우 15mL 튜브에 4mL
).
3. 밀도 구배 매체 위에 샘플을 조심스럽게 층을 이루고 RT.
   에서 30분 동안 400 x g의 원심분리기를 사용합니다. 알림: 온도 변화로 인해 단핵 세포의 농축이 저하될 수 있으므로 s를 원심분리기에 넣기 전에 원심분리기가 RT에 있는지 확인하고 급제동으로 액체 계면이 중단될 수 있으므로 원심분리기의 브레이크를 끄십시오.
4. 밀도 구배 매체와 CLL 세척 버퍼의 경계면에서 수집되는 단핵 세포의 흰색 층을 플라스틱 파스퇴르 피펫을 사용하여 새로운 50mL 원추형 원심분리 튜브로 부드럽게 수확합니다.
5. 분리된 단층에 40mL의 CLL 세척 버퍼를 추가하여 세포를 세척하고 RT에서 10분 동안 300 x g에서 원심분리합니다.
6. 상층액을 버리고 튜브 바닥을 튕겨 펠릿을 재현탁시킨 다음 1.5단계에서 설명한 세척 단계를 반복합니다.
7. 상등액을 버리고 1.6단계에서 설명한 대로 펠릿을 재현탁한 다음 설정된 부피의 CLL 세척 버퍼(세포 펠릿의 크기에 따라 최대 40mL)에 펠릿을 재현탁합니다.
8. 트리판 블루(trypan blue)와 혈구계(haemocytometer)를 사용하여 세포를 세어봅니다. 그런 다음 유세포 분석을 진행하여 CLL cells.
   의 순도를 확인합니다. 참고: 이 단계에서 CLL 세포는 실험에 사용할 배지에서 10 x 10⁶ cells/mL의 농도로 배양할 수 있으며, 최대 100 x 10⁶ cells/vial의 농도에서 향후 작업을 위해 10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)/FBS에 동결 보존할 수 있습니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
15 mL 튜브	그리너 바이오 원	188271
1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브	그리너 바이오 원	616201
디엠소	시그마	D2650
에디타	시그마	EDS (에디에스)
소 태아 세럼	써모피셔	10500064
Histopaque1077 밀도 구배 미디어	시그마	H8889
Trypan 블루 솔루션	써모피셔	15250061
PBS 정제	피셔 사이언티픽	BR0014G
RosetteSep 인간 B 세포 농축 칵테일	줄기세포 기술	15064
시그마 3-16P	사이퀵		원심 분리기