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1. CLL 세포에서 세포 내 분획의 준비
참고: 실험 설정을 계획할 때 전체 세포 추출물을 생성할 수 있는 자극되지 않은/처리되지 않은 세포의 웰을 포함하십시오.
- 10 – 20 x 106 cells/condition을 사용하여 MEC1 CLL 세포주 또는 분리된 1차 CLL 세포에 대해 원하는 자극 및/또는 약물 치료를 수행합니다. 그런 다음 세포는 세포 내 분획에 사용되거나 아래와 같이 전체 세포 추출물을 생성하는 데 사용됩니다.
- 용액/튜브 준비: 세포를 수확하기 전에 분별 당일에 모든 용액/완충액을 신선하게 준비합니다. 필요할 때까지 용액을 얼음에 보관하고 준비 후 4시간 이내에 사용하십시오.
- PBS/인산가수분해효소 억제제 용액: 인산가수분해효소 억제제를 1x PBS에서 1:20으로 희석하여 PBS에서 인산가수분해효소 억제제를 준비합니다(즉, 1x PBS 9.5mL에 인산가수분해효소 억제제 0.5mL).
메모: 인산가수분해효소 억제제가 침전되지 않았는지 확인합니다. 침전물이 있는 경우 50°C로 10분 동안 가열합니다.
- 히포토닉 버퍼: 증류수에 10x 하이포토닉 버퍼를 1:10 희석하여 1x 하이포토닉 버퍼를 준비합니다(즉, 50μL의 10x 하이포토닉 버퍼를 450 μ L의 dH2O로).
- 10mM 디티오트레이톨(DTT): 증류수(즉, 990μL의 dH2O에서 1M DTT의 10μL)로 1M DTT를 1:100 희석하여 10mM DTT를 준비합니다.
메모: DTT는 매우 불안정하므로 매번 새로 준비하십시오. 반복되는 동결/해동 주기를 피하십시오.
- 완전 용해 버퍼: 각 실험에 필요한 버퍼의 양을 결정합니다. 각 샘플에는 50μL의 완전 용해 완충액이 필요하므로 44.5μL의 용해 완충액에 5μL의 10mM DTT를 추가한 다음 0.5μL의 프로테아제 억제제 칵테일을 추가합니다. 이 양은 실험의 샘플 수에 따라 확장할 수 있습니다.
- 새로 자극된 세포, 새로 생성된 세포질 분획, 새로 생성된 핵 분획 및 전체 세포 용해물에 대한 각 자극 및/또는 약물 처리에 대해 1.5mL 마이크로분리 튜브 4세트에 라벨을 부착합니다. 필요할 때까지 이 마이크로퓨지 튜브를 얼음으로 미리 식히십시오.
- 4°C에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리하여 개별적으로 라벨링된 1.5mL 마이크로분리 튜브와 펠렛으로 세포를 옮깁니다. 상등액을 제거하고 1mL의 얼음처럼 차가운 PBS/포스파타제 억제제에 세포를 재현탁합니다. 4°C에서 5분 동안 200 x g에서 원심분리하여 세포를 펠렛화합니다.상등액을 제거하고 세포 펠릿을 얼음 위에 보관합니다.
- 세포질 분획의 준비: 50 μL의 1x 저장성 완충액에서 세포 내 분획에 사용할 세포 펠릿을 부드럽게 재현탁합니다. 세포가 팽창할 수 있도록 얼음 위에서 15분 동안 세포를 배양합니다.
메모: 사용되는 저장성 완충액의 부피는 세포 수에 따라 경험적으로 증가할 수 있습니다.
- 각 샘플에 0.8 - 2.5 μL(1:20 - 1:60)의 세제를 추가하고 가장 높은 설정에서 10초 동안 와류를 사용합니다.
- 핵 및 세포질 분획을 분리하기 위해 특정 세포 유형에 사용할 최적의 세제 농도를 결정하려면 초기에 세제 구배를 수행합니다. 1:20 - 1:60 범위(즉, 2.5 μL - 0.8 μL의 세제를 50 μL의 Hypotonic Buffer에 주입)가 적절해야 합니다.
메모: 3.4단계에서 저장성 완충액의 부피를 조정하면 적절한 세제 비율이 유지되는지 확인하십시오.
- 세제 첨가 전후에 위상차 현미경을 사용하여 세포를 관찰하여 세포 용해를 확인합니다. 전체 세포는 조밀하고 어두운 핵을 가지고 더 크게 보입니다. 세포질은 핵 주위에 밝은 후광으로 나타납니다.
메모: 적절한 용해는 웨스턴 블로팅(Western blotting)을 사용하여 세제 구배에서 생성된 용해된 분획 내의 특정 단백질을 분석함으로써 추가로 확인됩니다.
- 용해가 완료되면 14,000 x g에서 4°C에서 30초 동안 샘플을 원심분리합니다.
- 상층액을 미리 냉각되고 라벨이 부착된 마이크로퓨지 튜브에 조심스럽게 옮깁니다. 이 세포질 분획은 추가 분석이 필요할 때까지 -80 °C에서 보관할 수 있습니다. 나머지 펠릿에는 핵 분획이 포함되어 있습니다.
메모: 샘플의 반복적인 동결/해동 주기를 피하십시오.
- 핵 분획 준비: 위아래로 피펫팅하여 각 핵 펠릿을 50μL의 완전 용해 완충액에 재현탁합니다.
참고: 완전 용해 완충액의 부피는 시작 세포 수에 따라 경험적으로 조정할 수 있습니다.
- 2.5μL의 세제를 첨가하여 핵막 및 와류와 관련된 단백질을 10초 동안 가장 높은 설정에서 용해시킵니다. 얼음 위에서 샘플을 30분 동안 배양합니다.
- 가장 높은 설정에서 30초 동안 볼텍스를 사용한 다음 4°C에서 20분 동안 14,000 x g에서 샘플을 원심분리합니다.
- 상등액을 미리 냉각되고 라벨이 부착된 마이크로퓨지 튜브로 옮깁니다. 이 핵 분획은 추가 분석에 필요할 때까지 -80°C에서 보관할 수 있습니다.
메모: 샘플의 반복적인 동결/해동 주기를 피하십시오.