Extracellular Flux Assay: 세포의 대사 프로파일을 측정하는 방법

초록

출처: Hlozkova K. et al. 원발성 백혈병 세포의 대사 프로필 평가. J. Vis. 특급 (2018).

이 프로토콜은 세포외 플럭스 분석을 통해 1차 백혈병 세포의 세포외 산성화율(ECAR) 및 산소 소비율(OCR)을 측정하기 위한 생화학적 접근 방식을 제공합니다. 이러한 세포의 대사 프로파일에 대한 평가는 세포의 요구를 특성화하는 데 도움이 되어 맞춤형 치료로 이어집니다.

프로토콜

1. 시약의 준비

1. 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 4.3 mM Na₂HPO₄, 1.47 mM KH₂PO₄를 ddH₂O에 용해시켜 PBS 500 mL를 준비합니다. HCl로 pH를 7.4로 조정합니다. 오토 클레이브로 살균합니다.
2. RPMI 배지 100mL 준비: 10% 소 태아 혈청(FBS), 페니실린(100 U/mL) 및 스트렙토마이신(100 μg/mL)이 보충된 L-알라닐-글루타민이 함유된 RPMI-1640 배지.
3. 증류수에 0.1 M NaHCO₃ 50 mL를 준비합니다. pH를 8.1로 조정하고 필터 살균(0.22μm)하고 4°C에서 보관합니다.
   메모: 2개의 8웰 세포외 플럭스 분석기 플레이트에 대해 250μL의 0.1M NaHCO₃ pH 8.1을 준비합니다.
4. 증류수에 2M D-포도당 1mL를 준비합니다. 필터는 멸균(0.22μm)하고 -20°C에서 보관합니다.
5. 에탄올에 1mM 올리고마이신 A 100μL를 준비합니다. 필터는 멸균(0.22μm)하고 -20°C에서 보관합니다.
6. 최소 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's medium)에서 1M 2-deoxy-D-glucose(2-DG) 250μL를 준비합니다. 37°C로 예열하고 pH를 7.4로 조정합니다(37°C에서 pH 측정 수행). 필터는 멸균(0.22μm)하고 -20°C에서 보관합니다.
7. DMSO에서 1mM FCCP(카르보닐 시안화물-p-트리플루오로메톡시페닐히드라존) 100μL를 준비합니다. 필터는 멸균(0.22μm)하고 -20°C에서 보관합니다.
8. 에탄올에 1mM 로테논 100μL를 준비합니다. 필터는 멸균(0.22μm)하고 -20°C에서 보관합니다.
9. 에탄올에 1mg/mL 안티마이신 A 100μL를 준비합니다. 필터는 멸균(0.22μm)하고 -20°C에서 보관합니다.
10. 사용 직전에 해당과정 스트레스 테스트 배지 10mL를 준비합니다. 수조에서 최소 DMEM을 37°C로 가열하고 pH를 7.4로 조정합니다(37°C에서 pH 측정 수행).
11. 사용하기 전에 BSA가 함유된 세포 유사분열 스트레스 테스트 배지 10mL를 준비하십시오. 2mM L-글루타민, 10mM D-글루코오스, 1mM HEPES(pH 7.4), 1mM 피루브산 및 0.1% BSA(소 혈청 알부민)를 최소 DMEM으로 보충합니다. 수조에서 37°C로 데우고 pH를 7.4로 조정합니다(37°C에서 pH 측정 수행).
12. 사용하기 전에 BSA가 없는 세포 유사분 스트레스 테스트 배지 10mL를 준비하십시오. 2mM L-글루타민, 10mM D-글루코스, 1mM HEPES(pH 7.4) 및 1mM 피루브산으로 최소 DMEM을 보충합니다. BSA가 없는 Cell Mito 스트레스 테스트 매체를 수조에서 37°C로 가열하고 pH를 7.4로 조정합니다(37°C에서 pH 측정 수행).
    참고: BSA는 배지에 BSA가 보충될 때 세포가 FCCP에 더 잘 반응하기 때문에 세포 유사분 스트레스 테스트 배지에 추가됩니다(다른 조건이 테스트되었습니다). BSA가 없는 Cell Mito 스트레스 테스트 매체는 제조업체가 배지에 BSA를 사용하는 것을 권장하지 않기 때문에 포트를 로드하는 데 사용됩니다.

2. 단핵 세포의 하룻밤 배양

참고: 멸균 조직 배양 후드에서 모든 하위 단계를 수행합니다.

1. 20mL의 RPMI가 함유된 T75 플라스크 2개를 준비합니다. 각 플라스크에 30 x 10⁶개의 분리된 단핵 셀을 추가합니다. 플라스크를 5% CO₂ 및 37 °C에서 16-24시간 동안 서 있는 상태에서 세포를 배양합니다.

3. 셀 접착 코팅 플레이트의 준비

1. 2개의 8웰 세포외 플럭스 분석기 플레이트를 코팅합니다.
   메모: 멸균 조직 배양 후드에서 코팅을 수행합니다.
2. 2.2μL의 셀 접착제(밀도: 2.54mg/ml)를 250μL의 0.1M NaHCO₃, pH 8.1에 추가하고 용액 12.5μL를 각 웰에 즉시 피펫으로 넣습니다.
   메모: 셀 접착제 스톡 용액은 밀도가 다를 수 있으므로 그에 따라 NaHCO₃ 에 첨가되는 부피를 조정하십시오.
3. 플레이트를 후드에 약 20분 동안 두었다가 셀 접착제를 흡인하고 200μL의 멸균수를 사용하여 각 웰을 두 번 세척합니다. 우물이 마를 때까지 뚜껑을 열고 후드에 두십시오.
4. 플레이트를 즉시 사용하거나 결로를 방지하기 위해 테두리를 파라핀 필름으로 감싼 상태로 4°C에서 최대 1주일까지 절약하십시오. 세포를 파종하기 전에 후드에서 플레이트가 실온(약 20분 동안)으로 예열되었는지 확인하십시오.

4. 센서 카트리지의 수화

참고: 2개의 8웰 세포외 플럭스 분석기 카트리지를 수화합니다.

1. 유틸리티 플레이트와 센서 카트리지를 분리합니다. 센서 카트리지를 실험실 벤치에 거꾸로 놓습니다.
2. 유틸리티 플레이트의 각 웰을 200μL 캘리브런트로 채웁니다. 웰 외부의 각 해자를 400μL의 캘리브런트로 채웁니다.
3. 센서 카트리지를 이제 교정제가 들어 있는 유틸리티 플레이트에 다시 넣습니다.
4. 카트리지 어셈블리를 가습된 non-CO₂, 37 °C 인큐베이터에 밤새 넣습니다.
5. 세포외 플럭스 분석기를 켜고 밤새 37°C로 예열합니다.

5. Cell Adhesive-coated Plate의 세포 파종

참고: 해당과정 스트레스 테스트의 경우 해당과정 스트레스 테스트 매체를 사용하십시오. 세포 유사분 스트레스 테스트의 경우 BSA와 함께 세포 유사분 스트레스 테스트 배지를 사용하십시오.

1. 해당작용(glycolysis) 스트레스 테스트와 세포 유사분열 스트레스 테스트를 위한 종자 세포를 별도의 플레이트에 넣습니다. 각 테스트에는 하룻밤 배양과 함께 하나의 플라스크에서 추출한 세포를 사용합니다.
2. 실온에서 5분 동안 200 x g의 원심분리 셀. 적절한 배지 1mL에 세포를 재현탁하고 계수합니다.
3. 4 x 10⁶의 살아있는 세포를 최종 부피 400μL에 추가합니다(적절한 배지 사용).
4. 세포 현탁액의 50μL를 웰 B-G에 플레이트화합니다. 500,000개의 세포가 하나의 웰에 파종되었는지 확인합니다.
   메모: 다른 정규화는 수행되지 않으므로 웰당 정확히 500,000개의 세포를 시드하는 것이 중요합니다. 그렇게 하면 다른 환자의 결과를 비교할 수 있습니다. 최적의 반복 횟수는 여기에 설명된 대로 6회입니다. 일차 세포가 때때로 잘못 행동할 수 있으므로 더 적은 복제물을 사용하는 것은 권장되지 않습니다.
5. 180μL의 적절한 배지를 웰 A 및 H에 추가합니다(이 웰은 배경 보정으로 사용됨).
6. 브레이크를 400으로 설정하고 실온에서 5분 동안 플레이트를 1 x g로 원심분리합니다.
7. 2개의 8웰 세포외 플럭스 분석기 플레이트에 130μL의 적절한 배지를 웰 B-G에 천천히 조심스럽게 첨가합니다. 현미경으로 관찰하여 세포가 웰 바닥에 안정적으로 부착되어 있는지 육안으로 확인합니다.
8. 플레이트를 가습된 non-CO₂, 37 °C 인큐베이터에 30분 동안 넣습니다.

6. 센서 카트리지 넣기

1. 해당과정 스트레스 테스트를 위해 해당과정 스트레스 테스트 배지에서 각각 100mM 포도당, 20μM 올리고마이신 A 및 1M 2-DG를 각각 250μL씩 준비합니다.
2. 세포 미토(Mito) 스트레스 테스트의 경우, BSA가 없는 세포 미토(Mito) 스트레스 테스트 배지에서 20μM 올리고마이신 A, 15μM FCCP, 30μM FCCP 및 10μM 로테논 및 10μg/ml 안티마이신 A의 혼합물 각각 250μL를 준비합니다.
   메모: FCCP 적정을 위한 환자 물질이 충분하지 않기 때문에 한 번의 분석에서 두 가지 농도의 FCCP를 주입하는 것이 좋습니다. 그럼에도 불구하고 농도는 연구자가 결정해야 합니다.
3. 다음과 같이 화합물을 카트리지의 해당 주입기 포트에 로드합니다(표 1).

7. 프로그램 설정하기

1. 해당과정 스트레스 테스트의 경우 표 2에 설명된 대로 프로그램을 설정합니다.
2. 세포 유사분 스트레스 테스트의 경우 표 3에 설명된 대로 프로그램을 설정합니다.
3. 프로그램을 시작합니다. 캘리브런트 플레이트를 분석 플레이트로 교체합니다(메시지가 표시되면 ).

항구	해당과정 스트레스 테스트		세포 유사분열 스트레스 테스트
	포트에 로드	우물에서의 최종 농도	포트에 로드	우물에서의 최종 농도
ᅡ	20 μL의 100 mM 포도당	포도당 10mM	20μM 올리고마이신 A 20μL	2μM 올리고마이신 A
비	20μM 올리고마이신 A 22μL	2μM 올리고마이신 A	22μL의 15μM FCCP	1.5μM FCCP
씨	1m 2-DG의 25μL	100 mM 2-DG	25μL의 30μM FCCP	4.5μM FCCP
디	엑스		25 μL의 10 μM 로테논 및 10 μg/ml 안티마이신 A	1μM 로테논 및 1μg/ml 안티마이신 A

표 1: 복합 부피.

걸음	설정
교정	자동 번역
평형	자동 번역
기준선 측정	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 A의 주입	주사
측량	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 B의 주입	주사
측량	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 C의 주입	주사
측량	네 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분

표 2: 해당과정 스트레스 테스트 프로그램.

걸음	설정
교정	자동 번역
평형	자동 번역
기준선 측정	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 A의 주입	주사
측량	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 B의 주입	주사
측량	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 C의 주입	주사
측량	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분
포트 D의 주입	주사
측량	세 번: 믹스 – 3분, 대기 – 0분, 측정 – 3분

표 3: 세포 유사분열 스트레스 테스트를 위한 프로그램.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Seahorse 분석기 XFp	애질런트 테크놀로지스	S7802A는
Seahorse XFp 세포 배양 미니플레이트	애질런트 테크놀로지스	제103025-100
Corning™ Cell-Tak 세포 및 조직 접착제	써모피셔 사이언티픽	CB40240
D-(+) 포도당	시그마-알드리치	G7021-100G
올리고마이신 A	시그마-알드리치	75351-5MG
2-데옥시-D-글루코스	시그마-알드리치	D8375-1G
FCCP (영어)	시그마-알드리치	C2920-10MG
로테논	시그마-알드리치	R8875-1G
스트렙토마이세스 sp.에서 추출한 안티마이신 A.	시그마-알드리치	A8674-25MG
씨호스 XF 베이스 미디엄, 100mL	애질런트 테크놀로지스	제103193-100
L-글루타민 용액, 200mM	시그마-알드리치	G7513-100ML

호 호