T-세포 농축: 자기 분리를 통해 혼합 세포 집단에서 T-세포를 분리하는 기술

초록

출처: Nguyen, H. D., et al. 이식편대숙주질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하기 위한 골수 이식 플랫폼. J. Vis. 특급 (2020).

이 비디오는 자기 분리기를 사용하여 음성 선택을 통해 마우스의 비장에서 T 세포를 농축하는 방법을 설명합니다. 이 기술은 특정 세포 표면 항원에 대한 항체 또는 리간드를 사용하여 고갈을 위해 샘플의 다른 세포를 표적으로 삼는 것을 포함합니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

1. 1일차: 공여자 마우스의 T-세포 준비

1. CD45.2⁺ H2k^b+ C57BL/6 야생형(WT) 마우스를 T 세포의 공여체로 사용합니다.
2. C57BL/6 마우스를 이산화탄소(CO₂) 질식으로 안락사시키고 의식을 잃을 때까지 2-3분 동안 기다립니다. 필요한 경우 2차 안락사로 자궁경부 탈구를 수행합니다.
3. 70% 에탄올로 마우스의 털과 피부를 철저히 청소하십시오. 비장과 림프절을 절제하고 주사기 플런저와 40μm 메쉬 스트레이너를 사용하여 비장 세포의 단일 세포 현탁액으로 분리합니다. 스트레이너와 주사기 플런저를 1% RPMI(RPMI 배지를 포함하는 1% FBS)로 세척하여 모든 비장 세포를 수집합니다.
4. 세포 현탁액을 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.상등액을 버린 후 5mL의 ACK 용해 완충액(1mM Na₂EDTA, 10 mM KHCO₃, 144 mM NH₄Cl, pH 7.2)을 추가합니다. 실온에서 5분 동안 세포 현탁액을 배양합니다.
   메모: ACK 용해 버퍼는 적혈구를 용해하는 데 사용됩니다.
5. 용해를 중지하려면 1% RPMI 5mL를 추가합니다. 800 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층액을 버립니다.
6. 얼음처럼 차가운 MACS(magnetic-activated cell sorting) 완충액(0.5% BSA, PBS에서 2mM EDTA, pH 7.2)을 준비합니다. 사용하기 전에 버퍼를 제거하십시오. 세포 펠릿을 5mL의 MACS 완충액에 재현탁합니다.
7. 비장세포를 세고 혈구계와 1% 트리판 블루를 사용하여 살아있는 세포와 죽은 세포를 확인합니다. 2 x 10⁶ 세포의 분취량을 저장하여 유세포 분석으로 정제 수율을 평가합니다.
8. MACS 완충액에서 200 x 10⁶/mL 농도로 비장 세포를 재현탁합니다. 10⁶ 세포 당 0.03 μL의 비오틴 anti-mouse-Ter-119, 0.03 μL의 비오틴 anti-mouse-CD11b, 0.03 μL의 비오틴 anti-mouse-CD45R, 0.03 μL의 비오틴 anti-mouse-DX5를 추가합니다. 4 °C에서 15 분 동안 배양하십시오 .
   메모: 비오틴 anti-mouse-Ter-119, 비오틴 anti-mouse-CD11b, 비오틴 anti-mouse-CD45R 및 비오틴 anti-mouse-DX5를 사용하여 각각 적혈구, 과립구, B세포 및 NK 세포와 반응시켰습니다. 따라서 이러한 세포 하위 집합은 다음 단계에서 고갈됩니다.
9. 10mL의 얼음처럼 차가운 MACS 완충액을 세포 현탁액에 추가합니다. 800 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층액을 버립니다.
10. MACS 완충액의 세포 펠릿을 100 x 10⁶/mL의 농도로 재현탁합니다. 비장세포 현탁액에 항비오틴 마이크로비드(0.22 μL/10⁶ cells)를 추가합니다. 잘 섞어 4°C에서 15분 더 배양합니다. 얼음처럼 차가운 MACS 완충액 10mL로 세포 현탁액을 한 번 세척합니다. 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리기를 하고 상층액을 버립니다.
11. 자기장에 자기 분리 컬럼을 놓습니다. 3mL의 MACS 버퍼로 컬럼을 헹굽니다. 세포 현탁액을 컬럼에 떨어뜨립니다. 결합되지 않은 농축 T 세포로 구성된 플로우스루(flow-through)를 새로운 15mL 코니컬 튜브에 수집합니다. MS 컬럼을 얼음처럼 차가운 MACS 버퍼 3mL로 세척합니다.
    메모: 세척 단계를 수행하기 전에 컬럼이 비어 있는지 확인하십시오.
12. 세포 현탁액을 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.세포 펠렛을 MACS 완충액 5mL에 재현탁합니다.
13. 혈구계를 사용하여 1% 트리판 블루의 세포를 계산합니다. flow cytometry.
    에 의한 순도 검사를 위해 2 x 10⁶ cells의 부분 표본을 저장합니다. 메모: 이 방법으로 분리된 비장 T 세포의 평균 수율은 마우스당 ~20−25 x 10⁶ 세포입니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
RPMI 1640	써모 피셔 사이언티픽	11875-093	미디어
미디맥	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-042-302	T-세포 농축
0.5 M EDTA pH 8.0 100ML	피셔 사이언티픽	BP2482100	MACS 버퍼
10X PBS	피셔 사이언티픽	BP3994	MACS 버퍼
안티 비오틴 마이크로비즈	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-090-485	T-세포 농축
안티 휴먼/마우스 CD45R (B220)	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0452-85	T-세포 농축
안티 마우스 CD4 비오틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0041-86	T-세포 농축
CD11b	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0112-85	T-세포 농축
CD25-비오틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0251-82	T-세포 농축
CD45R	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-0452-82	T-세포 농축
CD49b 단클론 항체 (DX5)-biotin	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-5971-82	T-세포 농축
안티 마우스 TER-119 비오틴	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 13-5921-85	T-세포 농축
안티 마우스 CD45.1 PE	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	Tel.: 12-0900-83	유세포 분석
C57BL/6 마우스	찰스 리버	27	기부자/수혜자
유세포 분석 튜브	피셔 사이언티픽	352008	유세포 분석
셀 스트레이너 40 uM	써모 피셔 사이언티픽(Thermo Fisher Scientific	22363547	세포 준비

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