골수 유래 수지상 세포 생성: 마우스 골수에서 수지상 세포를 생성하는 방법

초록

출처:Nguyen, H. D., et al. 이식편대숙주질환에서 수지상 세포의 역할을 조사하기 위한 골수 이식 플랫폼. J. Vis. 특급. (2020).

이 비디오는 성체 쥐의 골수에서 수지상 세포(T 세포를 활성화하는 핵심 항원 제시 세포)를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

1. 골수 유래 수지상 세포(BM-DC)를 생성합니다.

1. B6 배경에 있는 WT 또는 인자 B(fB)^-/- 마우스의 대퇴골 및 경골에서 골수를 분리합니다. 간단히 집게와 가위를 사용하여 양쪽 다리의 경골과 대퇴골을 채취합니다. 50mL 코니컬 튜브에 1% FCS와 100U/mL 페니실린/스트렙토마이신, 2mM L-글루타민(1% RPMI)이 함유된 얼음처럼 차가운 RPMI에 넣습니다. 집게와 가위를 사용하여 모든 근육 조직을 제거하여 대퇴골과 경골 뼈를 철저히 청소합니다. 50mL 원뿔형 튜브의 대퇴골과 경골을 1% RPMI가 함유된 92mm 직경의 페트리 접시로 옮깁니다. 가위를 사용하여 대퇴골 또는 경골의 끝을 자릅니다. 50mL 튜브에 1% RPMI 1640 배지 25mL를 채웁니다. 이를 사용하여 26G 바늘에 부착된 3mL 주사기에 3mL의 1% RPMI를 채웁니다. 이 주사기를 뼈에 삽입하고 플런저를 밀어 1% RPMI(~3mL/뼈)로 골수(BM)를 공동에서 채취 튜브로 씻어냅니다. 800 x g에서 5분 동안 셀을 회전시킵니다.
2. 적혈구 용해를 위해 5mL의 ACK 용해 완충액에 펠릿을 재현탁합니다. 얼음 위에서 5분 동안 세포 현탁액을 배양합니다. 세포 현탁액에 1% RPMI 10mL를 첨가하여 용해를 중지하고 800 x g에서 4°C에서 5분 동안 원심분리를 합니다. 상층액을 폐기합니다.
3. 세포 펠릿을 10mL의 배양 배지(10% FBS, 100U/mL의 페니실린/스트렙토마이신, 2mM l-글루타민 및 50mM β-메르캅토에탄올을 함유한 RPMI 1640)에 재현탁하고 최종 농도인 2 x 10⁶ cells/mL를 충족하도록 부피를 조정합니다.
4. 세포 현탁액에 20ng/mL 과립구-대식세포 집락 자극 인자(GM-CSF)를 추가합니다. 골수 세포를 100 x 15 mm 페트리 접시에서 37 ° C에서 5 % CO₂에 6 일 동안 배양합니다.
5. 3일차에 진행 중인 배양 배지의 절반(약 5mL)을 40ng/mL GM-CSF를 함유한 신선한 배지로 교체합니다.
6. 37°C의 수조에서 배양 배지를 예열합니다.골수 배양 접시에서 약 5mL의 배지를 수집합니다. 800 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층액을 버립니다. 40ng/mL GM-CSF를 함유한 5mL 배양 배지에 세포 펠렛을 재현탁합니다.
7. 배양 6일차에 25μg/mL 지질다당류(LPS)를 배지에 첨가하여 BM-DC를 성숙시킵니다.2 x 10⁶ 세포의 분취액을 저장하여 유세포 분석으로 DC 분화 효능을 확인합니다.
8. 성숙한 BM-DC 수집: 셀 리프터를 사용하여 페트리 접시에서 DC를 부드럽게 긁어냅니다. 모든 세포 현탁액을 50mL 코니컬 튜브에 수집합니다. 800 x g에서 4 °C에서 5 분 동안 원심 분리기. 상층액을 버립니다. 세포 펠릿을 얼음처럼 차가운 PBS 50mL로 3번 세척합니다. 유세포 분석에 의한 면역학적 표현형 분석을 위해 약 2 x 10⁶ BM-DC를 저장합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
10X PBS	피셔 사이언티픽	BP3994	MACS 버퍼
B6 fB-/- 마우스	센트럴 플로리다 대학교	사내에서	받는 사람
나6. Ly5.1 (CD45.1 +) 마우스	찰스 리버	546	기증자
BALB/c 마우스	찰스 리버	28	이식 수혜자
C57BL/6 마우스	찰스 리버	27	기부자/수혜자
소 태아 세럼(FBS)	애틀랜타 Bilogicals R&D 시스템	D17051	세포 배양
리포폴리사카라이드(LPS)	밀리포어 시그마	L4391-1MG	DC 성숙
뉴 브런즈윅 갤럭시 170R 인큐베이터	에펜도르프	갤럭시 170 R	세포 배양
페니실린+스트렙토마이신페니실린/ 스트렙토마이신(10,000 units 페니실린 / 10,000 mg/ml 연쇄상구균)	지브코	15140	미디어
RPMI 1640	써모 피셔 사이언티픽	11875-093	미디어