방법 논문

염색질 전단(Chromatin Shearing): 효소 분해를 사용하여 염색질 단편을 생성하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

출처: Fuchs, A. R. et al. 만성 림프구성 백혈병에서 새로운 NFAT2 표적 유전자를 식별하기 위한 염색질 면역침전 분석. J. Vis. 특급.(2018).

이 비디오는 미세구균 뉴클레아제 효소 분해를 사용한 염색질 전단 프로토콜에 대해 설명합니다. 염색질 전단은 인간 만성 골수성 백혈병 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 조사하는 데 도움이 되는 염색질 면역침전 또는 ChIp 워크플로우의 필수 단계입니다. 기능 프로토콜에서 염색질 전단은 초음파 처리를 사용하여 수행됩니다.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. 고정, 세포 용해 및 염색질 전단

참고: 환자 샘플과 Jurkat 세포는 이전에 설명된 대로 수정하여 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ChIP 키트로 고정 및 용해됩니다. 고정은 층류 후드 아래에서 수행됩니다.

  1. 37% 포름알데히드 1mL가 함유된 1.5mL 튜브, 1.25M 글리신 1mL가 함유된 1.5mL 튜브, 1x PBS 4mL가 함유된 5mL 튜브 및 세포 고정을 위한 얼음이 담긴 상자를 준비합니다.
  2. 각각의 배양 시간 동안 세포를 자극한 후, 32.4 nM 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA) 및 1 μM 이오노마이신을 첨가하여 세포를 자극한다. 그런 다음 튜브의 뚜껑을 연 상태에서 37°C 및 5%CO2에서 16시간 동안 세포를 배양합니다(오염을 방지하기 위해 공기 투과성 밀봉 필름을 사용하고 5mL 튜브를 200 x g에서 5분 동안 회전시키고 5mL 튜브에서 500μL의 PBS에 세포를 재현탁합니다.
  3. 세포에 340μM 포름알데히드(37% 포름알데히드 13.5μL)를 추가합니다. 조심스럽게 위아래로 피펫팅하여 간단히 혼합한 후 실온에서 2.5분(Jurkat 세포) 또는 5분(환자 샘플) 동안 현탁액을 배양합니다.
    메모: 최적의 전단을 보장하기 위해 일차 세포에 장시간의 고정 시간이 필요합니다.
  4. 125mM 글리신(1.25M 글리신 57μL)을 첨가하여 고정을 중지하고 5분 더 배양합니다. 그 직후 세포를 얼음에 놓고 4°C에서 5분 동안 500 x g에서 원심분리합니다. 흡인으로 상등액을 제거합니다.
  5. 4°C에서 5분 동안 200 x g의 얼음처럼 차가운 PBS 1mL로 세포를 두 번 세척하고 흡인으로 매번 상층액을 제거합니다.
    메모: 고정 후 프로토콜을 일시 중지할 수 있습니다. 고정 셀은 -80 °C에서 보관해야 합니다. 테스트를 위해 다음 프로토콜에서 사용하려는 항체의 에피토프가 고정을 통해 마스킹되지 않은 경우 SDS-PAGE 겔 전기영동 및 웨스턴 블롯을 통한 분석에 추가 샘플을 사용할 수 있습니다. 이 단계는 제조업체의 지침에 따라 100μg의 단백질로 수행됩니다. 모든 αNFAT2 항체는 1:1000의 희석으로 사용되고, GAPDH 항체는 1:10000의 희석으로 사용됩니다. 적절한 항체와 부적절한 항체를 가진 Jurkat 세포의 고정 샘플의 예시적인 이미지가 그림 1에 나와 있습니다.
  6. 위아래로 피펫팅하여 시판되는 5mL의 lysis buffer 1에 세포 펠릿을 재현탁합니다. 그런 다음 샘플을 얼음 위에 올려 셰이커에 놓고 흔들면서 10분 동안 배양합니다.
    메모: 용해 전에 세포는 액체 질소에서 10초 동안 분해될 수 있습니다. 이는 Jurkat 세포에 유용하지만 1차 환자 샘플에서는 피해야 합니다. 분해를 위해 특정 용기에 5-10mL의 액체 질소에 5mL 튜브를 5초 동안 놓습니다. 보안경과 적절한 안전 장갑을 착용하십시오.
  7. 그 후, 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  8. 위아래로 피펫팅하여 시판되는 lysis buffer 2 5mL의 세포를 균질화하고 흔들면서 얼음 위에서 10분 동안 배양합니다. 그런 다음 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 튜브를 원심분리하고 피펫팅으로 상층액을 조심스럽게 제거합니다.
  9. 1x 프로테아제 억제제(각각 5μL 또는 1.4μL)를 함유한 전단 완충액 1의 500μL(Jurkat 세포) 또는 140μL(환자 샘플)에 세포 펠릿을 재현탁하고 혼합물을 얼음에서 10분 동안 배양합니다.
  10. 염색질 전단의 경우, 1.9 단계에서 세포 현탁액 140 μL를 초음파 처리기 튜브로 옮깁니다 (기포 생성을 피하고 샘플 부피로 인해 필요한 경우이 단계를 반복하십시오). 7 ° C의 온도에서 집속 초음파 처리기에 튜브를 놓고 평균 입사 전력 9.375W로 10 분 (세포주) 또는 7.5 분 (환자 샘플) 동안 전단하여 200-500 bp DNA 단편을 얻습니다.
  11. 마지막으로, 작은 원심분리기에서 15700 x g에서 4°C에서 10분 동안 원심분리하고 새 1.5mL 튜브에 상층액을 수집합니다.
  12. 적절한 단편 크기를 테스트하려면 1.5% TBE 아가로스 겔에서 겔-전기영동을 통해 전단된 염색질 20μL를 분석합니다. 품질이 좋은 Jurkat 세포와 나쁜 세포에서 전단된 염색질의 예시적인 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 이 시점에서 프로토콜이 잠재적으로 일시 중지될 수 있습니다. 전단 염색질은 -80 °C에서 보관해야 합니다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

결과

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
그림 1: SDS-PAGE 및 Western-Blot으로 평가한 고정 Jurkat 세포에서의 항체 성능 예. (a) Jurkat 세포를 0분(밴드 A 및 D), 2.5분(밴드 B 및 E) 또는 5분(C 및 F) 동안 고정하고 다른 제조업체(밴드 A-C = 제조업체 1, 밴드 D-F = 제조업체 2)의 αNFAT2-항체(클론 7A6)를 비교했습니다. 제조사 1의 항체는 전반적으로 더 나은 성능을 보였으며, 고정된 샘플에 대해서도 더 높은 친화력으로 결합했습니다(A-C 밴드와 D-F 밴드 비교). (b) 다른 제조사의 αNFAT2-항체(클론 D15F1)를 사용하였다. 이 항체는 고정되지 않은 샘플(밴드 A)에...

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
37 % 포름알데히드 p.a., ACS로스4979.1
1 X PBS시그마 알드리치D8537
1.5mL 튜브 쉐이커 Themomixer 컴포트에펜도르프5355 000.011유사한 기기로 대체 가능
M220 집속 초음파 발생기코바리스500295
20X Bolt MES SDS 러닝 버퍼써모 사이언티픽(Thermo ScientificB0002
트리스 완충 식염수(TBS-10X)세포 신호 전달#의 12498
iBlot 2 젤 전사 장치 써모 사이언티픽(Thermo ScientificIB21001
iBlot 2 전사 스택, 니트로셀룰로오스, 레귤러 사이즈써모 사이언티픽(Thermo ScientificB23001
큰 원심분리기에펜도르프5804R유사한 기기로 대체 가능
DNA LoBind 튜브 1.5 mL에펜도르프22431021
Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(100X)써모 사이언티픽(Thermo Scientific78440
소형 원심분리기써모 사이언티픽(Thermo Scientific헤레우스 프레스코 17
밀도 구배 매체 Biocoll (밀도 1,077 g/ml)머 크패 6115
) ) ) ) )

재인쇄 및 허가

이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

허가 요청

태그

DNATBE

관련 논문