염색질 면역침전 분석법: 세포에서 단백질-DNA 상호 작용을 연구하는 기술

초록

출처: Fuchs, A. R.,et al. 만성 림프구성 백혈병에서 새로운 NFAT2 표적 유전자를 식별하기 위한 염색질 면역침전 분석. J. Vis. 특급 (2018).

이 동영상은 단백질-DNA 상호작용을 입증하는 고전적인 기술인 염색질 면역침전(ChIP) 분석 프로토콜에 대해 설명합니다. 이 기술은 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 표적 유전자를 확인하는 데 사용됩니다.

프로토콜

1. 염색질 면역침전

참고: 염색질 면역침전은 제조업체의 지침에 따라 시판되는 ChIP 키트로 수정하여 수행되었습니다.

1. 면역침전(70 μL(Jurkat 세포) 또는 15 μL(환자 샘플)의 전단 염색질과 하나의 항체)을 계산하고 1.5 mL 튜브에서 침전당 20 μL의 단백질 A 코팅 비드를 준비합니다. 위아래로 피펫팅하여 침전당 1 1 40 μL의 비드를 세척하고, 비드를 마그네틱 랙에 1분 동안 두었다가 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 이 단계를 총 4번 수행합니다. 결국 1x ChIP 버퍼 1을 사용하여 원래 볼륨의 비드를 다시 현탁합니다.
2. 면역침전 자체의 경우, 10μg의 αNFAT2 항체(7A6)를 사용하여 결합된 타겟 염기서열과 함께 NFAT2를 캡처합니다. IgG 대조군으로 토끼 IgG 항체(DA1E) 2.5μg을 사용합니다. 표 1.
   에 표시된 대로 새 1.5mL 튜브에서 반응을 준비합니다. 참고: 이 프로토콜에 대한 고정 중에 에피토프가 마스킹되지 않는 친화도가 높은 단클론 항체를 사용하는 것이 중요합니다. 다클론 항체는 추가적인 수준의 변이를 도입하여 수신된 결과를 적절하게 해석하는 것을 훨씬 더 어렵게 만듭니다.
3. 1.2 단계의 혼합물을 6 rpm으로 회전하는 바퀴에서 4 ° C에서 밤새 배양합니다.
4. 다음 날 소형 원심분리기에서 7,000 x g의 속도로 튜브를 5초 동안 돌리고 마그네틱 랙에서 1분 동안 배양한 다음 흡인으로 상층액을 제거합니다. 각 세척 버퍼 1, 2, 3 및 4를 사용하여 비드를 한 번씩 연속적으로 세척합니다.
5. 이렇게 하려면 비드를 350μL의 세척 버퍼에 다시 현탁시키고 6rpm의 회전 휠에서 4°C에서 5분 동안 배양합니다.
6. 그런 다음 작은 원심분리기에서 5 x g에서 7000초 동안 튜브를 돌립니다. 그런 다음 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 상층액을 제거한 후 다음 세척 버퍼를 추가합니다.
7. 마지막 세척 단계 후 피펫팅으로 상층액을 제거하고 100μL의 용리 완충액 1에 비드를 넣고 6rpm으로 회전하는 휠에서 30분 동안 배양합니다.
8. 튜브를 짧게 돌리고(작은 원심분리기에서 7000 x g에서 5초) 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다.
9. 그런 다음 피펫팅을 통해 상층액을 새 1.5mL 튜브로 옮기고 4μL의 용리 완충액 2를 추가합니다.
10. 입력 대조군을 생성하려면 1μL의 전단 염색질을 99μL의 용리 완충액 1 및 4μL의 용리 완충액 2와 혼합합니다(이 설정에서는 환자당 3개의 튜브가 있습니다. 입력 대조군 1개, IgG 대조군 1개, αNFAT2 샘플 1개).
11. 1.5mL 튜브 셰이커에서 65°C 및 1300rpm에서 4시간 동안 샘플을 배양합니다. 100μL의 100% 이소프로판올, 와류를 넣고 소형 원심분리기에서 7000 x g로 5초 동안 샘플을 회전시킵니다.
12. 완전히 와류를 통해 사용 가능한 마그네틱 비드를 재현탁하고, 모든 샘플에 10μL의 비드를 첨가하고, 6rpm의 회전 휠에서 실온에서 1시간 동안 배양합니다.
13. 배양 후 작은 원심분리기에서 7000 x g으로 튜브를 5초 동안 돌리고 마그네틱 랙에 1분 동안 놓습니다. 흡인에 의해 상층액을 제거합니다.
14. 비드를 100μL의 세척 버퍼 1에 재현탁합니다. 튜브를 뒤집어 섞고 6rpm으로 회전하는 휠에서 실온에서 5분 동안 배양합니다.
15. 작은 원심분리기에서 7000 x g의 속도로 튜브를 5초 동안 돌리고 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 피펫팅으로 상층액을 제거합니다. 세척 버퍼 2를 사용하여 2.13-2.14 단계를 반복합니다.
16. 그 후, 흡인에 의해 세척 완충액을 제거하고, 55μL의 용출 완충액에 비드를 재현탁탁하고, 6rpm의 회전 휠에서 실온에서 15분 동안 배양하여 침전된 DNA를 용리시킵니다. 마지막으로, 소형 원심분리기에서 7000 x g의 속도로 튜브를 5초 동안 돌리고 마그네틱 랙에 1분 동안 놓고 상층액을 새 1.5mL 튜브로 옮깁니다.
    메모: 여기서 프로토콜이 잠재적으로 일시 중지될 수 있습니다. 그런 다음 용출된 DNA를 -20°C에서 보관해야 합니다.

분 분 명

항목	IP당 부피(μL)
5% BSA	6
100 x 프로테아제 억제제	3
5 x ChIP 버퍼 1	56
전단 염색질	x (15 μL 또는 70 μL)
단백질 A 코팅 마그네틱 비드	20
ChIP seq 등급 물	185-X-Y
항체 (αNFAT2 또는 IgG-control)	y(1.09 μL 또는 1 μL)
합계	270

표 1: 염색질 면역침전(chromatin immunoprecipitation)을 파이펫팅하기 위한 일정. 염색질 면역침전은 표에 나타난 바와 같이 반응을 준비하여 수행하였다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
항-NFAT2 항체	알 렉시스	1008505	클론 7A6
항-NFAT2 항체	세포 신호 전달	8032분	클론 D15F1
Anti-NFAT2 항체 ChIP 등급	아브캠	AB2796	클론 7A6
마그네틱 랙, DynaMag-15 자석	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	12301디	유사한 기기로 대체 가능
Histones용 iDeal ChIp-seq 키트	다이아게노드	C01010059
소형 원심분리기	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	헤레우스 프레스코 17	유사한 기기로 대체 가능
셰이커 듀오맥스 1030	Heidolph 악기	Tel.: 543-32205-00	유사한 기기로 대체 가능
Halt 프로테아제 및 포스파타제 억제제 칵테일(100X)	써모 사이언티픽(Thermo Scientific	78440
IRDye 680LT 당나귀 안티 토끼 IgG (H + L), 0.5 mg	LI-COR 생명과학	926-68023
IRDye 800CW 염소 안티 마우스 IgG (H + L), 0.1 mg	LI-COR 생명과학	925-32210
DNA LoBind 튜브 1.5 mL	에펜도르프	22431021
FBS 슈페리어	머 크	S0615
37 % 포름알데히드 p.a., ACS	로스	4979.1
1 X PBS	시그마 알드리치	D8537
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