HSPC 클론의 배양 및 수확: 단일하게 분류된 HSPC 클론을 얻는 방법

초록

출처: Huber, AR, et al. 인간 혈액의 돌연변이 부하 및 클론 구성 특성화. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 골수에서 HSPC를 분리하고 단일 정렬된 HSPC를 얻는 방법인 형광 활성화 세포 분류 기술을 사용하여 HSPC를 분류하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이렇게 분류된 세포를 배양하여 HSPC 클론을 얻습니다.

프로토콜

1. HSPC 격리, 정렬 및 문화권

1. 350 x g에서 5분 동안 1–2 x 10⁷ 단핵 세포에서 스핀다운하고 50μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 세포 펠릿을 100μL의 항-CD3 염색 용액(FACS 완충액에서 항-CD 항체 1:100 희석)에 재현탁합니다. 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   참고: >2 x 10⁷ cells로 분류할 때 그에 따라 항체 믹스와 FACS 완충 부피를 늘리십시오.
2. 표 1에 나타난 레시피에 따라 50μL의 2x HSC 염색 혼합물을 준비합니다.
3. 50μL의 세포 용액을 준비된 HSC 염색 혼합물과 혼합하고 실온(RT)에서 15분 동안 또는 항체가 결합할 수 있도록 얼음에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
4. 1mL의 FACS 완충액과 펠렛을 첨가하여 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
5. 300μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하고 35μm 세포 스트레이너 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 튜브를 통해 세포 현탁액을 여과하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 전에 세포 덩어리를 제거합니다.
6. 100ng/mL SCF, 100ng/mL Flt3, 50ng/mL TPO, 10ng/mL IL-3, 20ng/mL IL-6 및 100ng/mL 항생제 제형이 보충된 1x SFEM 배지로 구성된 25mL의 HSPC 배양 배지를 준비합니다(재료 표 참조).
7. 384웰 세포 배양 플레이트에 각 웰에 75μL의 HSPC 배양 배지를 채웁니다.
   참고: 외부 웰에서 매체의 증발을 방지하려면 외부 웰에 75μL의 멸균수 또는 PBS를 채우고 이러한 웰을 세포 분류에 사용하지 마십시오.
8. 단일 HSPC 정렬
   1. 염색되지 않은 대조군(단일 정렬된 HSC)과 염색된 샘플의 10,000개 세포를 기반으로 HSPC 분류를 위한 게이트를 설정합니다. 게이트 설정을 위한 대표적인 결과가 그림 1에 나와 있습니다. 선형 FSC-높이 대 FSC-면적 분율 주위에 게이트를 그려 단일 셀을 게이트합니다. 염색되지 않은 제어 분수를 ^{사용하여 계보} 분획에 대한 게이트를 그립니다. CD34⁺ 세포에 대한 게이트를 그리고 CD38^- CD45RA- 세포에 대한 특정 게이트를 설정하여 이 하위 집합을 추가로 특성화합니다.
   2. FACS 기계에 384 웰 플레이트를 로드하고 단일 셀을 정렬합니다.
      참고: FACS 기계에 적용 가능한 경우 정렬된 셀을 다시 추적할 수 있도록 인덱스 정렬 데이터를 유지하는 옵션을 켭니다.
9. 단일하게 정렬된 HSC 배양
   1. 384웰 플레이트를 5% CO₂.
      의 가습된 37°C 인큐베이터로 직접 옮깁니다. 메모: 배양 중 증발을 방지하기 위해 384웰 배양 플레이트(뚜껑 포함)를 투명 폴리에틸렌 랩으로 감쌉니다.
   2. 눈에 보이는 클론이 나타날 때까지 384 웰 플레이트를 3-4주 동안 인큐베이터에 보관합니다. 클론 배양의 대표적인 이미지가 그림 2에 나와 있습니다. 입력 물질의 상태에 따라 정렬된 세포의 5%–30%가 클론으로 확장됩니다.

개 개 개 개 개 개 (영어) 개 년

항체	부피 [μL]
BV421-CD34	5
FITC-리니지 믹스 (CD3/14/19/20/56)	5
PE-CD38	2
APC-CD90	0.5
퍼CP/Cy5.5 - CD45RA	5
PE/Cy7- CD49f	1
핏씨 -CD16	1
FITC-CD11	5
FACS 버퍼	25.5

표 1: HSC 분류 혼합.HSC를 분류하는 데 사용되는 항체의 희석액을 나타내는 표가 나와 있습니다.

2. HSPC 클론 수집

1. 4주간의 배양 후 어떤 웰의 포화도가 30% 이상인지 확인합니다.
2. PBS에 1% BSA 1mL로 1.5mL 마이크로튜브를 미리 채우고(각 클론 추출물에 대해) 해당 웰에 따라 튜브에 라벨을 붙입니다.
3. PBS에서 1% BSA로 피펫 팁을 미리 적셔 피펫 팁에 달라붙는 세포의 수를 최소화합니다.
4. 200μL 피펫(75μL로 설정)으로 웰의 배지를 격렬하게(최소 5회) 위/아래로 피펫하고 웰 바닥을 긁어 웰의 세포를 느슨하게 하고 웰에 해당하는 라벨링된 마이크로튜브에 세포 현탁액을 수집합니다.
5. PBS에서 75 μL의 신선한 1% BSA를 취하고 웰에서 피펫팅을 반복하여 세포의 최대 흡수를 보장합니다.
   참고: 클론 배양된 세포는 웰 바닥에 달라붙을 수 있습니다. 표준 도립 광 현미경을 사용하여 웰을 검사하여 모든 세포가 수집되었는지 확인합니다.
6. >30%의 포화도를 가진 모든 웰을 수확한 경우 384웰 플레이트를 인큐베이터에 다시 넣습니다. 클론 배양은 최대 5주 동안 증식할 수 있습니다.
7. 350 x g에서 5분 동안 셀 현탁액을 스핀다운합니다. 작은 펠릿이 보여야 합니다.
8. 약 5μL의 상층액을 제외한 모든 상층액을 조심스럽게 제거합니다. 세포 펠릿은 -20°C에서 동결하고 DNA 분리 전에 수개월 동안 보관할 수 있습니다.

결과

그림 1: 입력 자료를 기반으로 한 실험 절차를 보여주는 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 세포 분류 전략.첫째, 게이팅은 작은 단핵 세포에서 수행됩니다. 둘째, 단일 셀은 선형 분수의 선택에 의해 게이트됩니다. 계통 음성 세포는 게이트가 있습니다. 모...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD11c 핏씨	바이오레전드	301603	클론 3.9
CD16 핏씨	바이오레전드	302005	클론 3G8
CD3 BV650	바이오레전드	300467	클론 UCHT1
CD34 BV421	바이오레전드	343609	561
CD38 PE	바이오레전드	303505	클론 HIT2
CD45RA 퍼CP/싸이5.5	바이오레전드	304121	클론 HI100
CD49f PE/싸이7	바이오레전드	313621	클론 GoH3
CD90 에이피	바이오레전드	328113	클론 5E10
Cell Strainer 5 mL 튜브	코 닝	352235
CELLSTAR 플레이트, 384w, 130 μL, F-bottom, TC, 커버	그라이너	781182
Human Flt3-Ligand, 프리미엄급	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-479	PBS 내 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(25μL)에 재반응
인간 재조합 IL-3 (E. coli 발현)	줄기세포 기술	78040.1	PBS의 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(2.5μL)에서 재조정
인간 재조합 IL-6 (E. coliexpressed)	줄기세포 기술	78050.1	PBS의 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(5μL)에서 재조정
Human SCF, 프리미엄급	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-695	PBS 내 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(25μL)에 재반응
인간 TPO, 프리미엄급	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-095-752	PBS의 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(12.5μL)에서 재조정
계보 (CD3/14/19/20/56) FITC	바이오레전드	348701	클론: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
PBS (PBS)			연구소 시설에서 제조되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 PBS도 사용할 수 있습니다
프리모신	인비보젠	개미-PM-1	항생제 제형

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