HSPC 클론의 배양 및 수확: 단일하게 분류된 HSPC 클론을 얻는 방법

초록

출처: Huber, AR, et al. 인간 혈액의 돌연변이 부하 및 클론 구성 특성화. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 골수에서 HSPC를 분리하고 단일 정렬된 HSPC를 얻는 방법인 형광 활성화 세포 분류 기술을 사용하여 HSPC를 분류하는 프로토콜에 대해 설명합니다. 이렇게 분류된 세포를 배양하여 HSPC 클론을 얻습니다.

프로토콜

1. HSPC 격리, 정렬 및 문화권

1. 350 x g에서 5분 동안 1–2 x 10⁷ 단핵 세포에서 스핀다운하고 50μL의 FACS 완충액에 재현탁합니다. 세포 펠릿을 100μL의 항-CD3 염색 용액(FACS 완충액에서 항-CD 항체 1:100 희석)에 재현탁합니다. 세포를 마이크로 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
   참고: >2 x 10⁷ cells로 분류할 때 그에 따라 항체 믹스와 FACS 완충 부피를 늘리십시오.
2. 표 1에 나타난 레시피에 따라 50μL의 2x HSC 염색 혼합물을 준비합니다.
3. 50μL의 세포 용액을 준비된 HSC 염색 혼합물과 혼합하고 실온(RT)에서 15분 동안 또는 항체가 결합할 수 있도록 얼음에서 1시간 동안 세포를 배양합니다.
4. 1mL의 FACS 완충액과 펠렛을 첨가하여 350 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
5. 300μL의 FACS 완충액에 세포를 재현탁하고 35μm 세포 스트레이너 캡이 있는 5mL 폴리스티렌 튜브를 통해 세포 현탁액을 여과하여 형광 활성화 세포 분류(FACS) 전에 세포 덩어리를 제거합니다.

결과

그림 1: 입력 자료를 기반으로 한 실험 절차를 보여주는 순서도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2: 세포 분류 전략.첫째, 게이팅은 작은 단핵 세포에서 수행됩니다. 둘째, 단일 셀은 선형 분수의 선택에 의해 게이트됩니다. 계통 음성 세포는 게이트가 있습니다. 모.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
CD11c 핏씨	바이오레전드	301603	클론 3.9
CD16 핏씨	바이오레전드	302005	클론 3G8
CD3 BV650	바이오레전드	300467	클론 UCHT1
CD34 BV421	바이오레전드	343609	561
CD38 PE	바이오레전드	303505	클론 HIT2
CD45RA 퍼CP/싸이5.5	바이오레전드	304121	클론 HI100
CD49f PE/싸이7	바이오레전드	313621	클론 GoH3
CD90 에이피	바이오레전드	328113	클론 5E10
Cell Strainer 5 mL 튜브	코 닝	352235
CELLSTAR 플레이트, 384w, 130 μL, F-bottom, TC, 커버	그라이너	781182
Human Flt3-Ligand, 프리미엄급	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-479	PBS 내 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(25μL)에 재반응
인간 재조합 IL-3 (E. coli 발현)	줄기세포 기술	78040.1	PBS의 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(2.5μL)에서 재조정
인간 재조합 IL-6 (E. coliexpressed)	줄기세포 기술	78050.1	PBS의 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(5μL)에서 재조정
Human SCF, 프리미엄급	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-096-695	PBS 내 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(25μL)에 재반응
인간 TPO, 프리미엄급	밀테니 바이오텍	Tel.: 130-095-752	PBS의 0.1% BSA에서 100μg/mL로 일회용 부분 표본(12.5μL)에서 재조정
계보 (CD3/14/19/20/56) FITC	바이오레전드	348701	클론: UCHT1, HCD14, HIB19, 2H7, HCD56
PBS (PBS)			연구소 시설에서 제조되었습니다. 상업적으로 이용 가능한 PBS도 사용할 수 있습니다
프리모신	인비보젠	개미-PM-1	항생제 제형

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