Magnetic-Activated Cell Sorting: c-kit 양성 세포를 분리하는 방법

초록

출처: Kesarwani, M., et al. 종양유전자 의존성에서 c-fos 및 dusp1의 역할을 평가하는 방법. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 마우스의 골수에서 c-kit 양성 세포를 분리하는 기술에 대해 설명합니다. 이 프로토콜에서는 형질전환 마우스에서 c-kit 양성 세포를 분리하여 c-Fos 및 Dusp1을 단독으로 또는 함께 백혈병의 약물 표적으로 검증할 것입니다.

프로토콜

동물 모델과 관련된 모든 절차는 지역 기관 동물 관리 위원회와 JoVE 수의학 검토 위원회에서 검토되었습니다.

골수에서 c-Kit⁺ 세포 분리

1. 제도적 지침에 따라 쥐를 희생시킵니다.
   참고: 여기서, 마우스는 AVMA 권장 유속에 따라 이산화탄소(CO₂)에 노출되어 호흡과 심장 박동이 중단되고 자궁 경부 탈구가 뒤따를 때까지 사망이 결정되었습니다.
2. 쥐에서 다리 뼈(대퇴골 2개, 경골 2개, 장골 2개)를 채취합니다. 메스로 뼈의 모든 조직을 긁어냅니다. 다리 뼈를 얼음 위에 1x PBS의 차가운 물에 넣습니다(15mL 튜브에 5mL). 튜브의 내용물을 절구에 붓고 유봉으로 으깬다.
3. 피펫을 사용하여 70μm 세포 스트레이너를 통해 10mL 피펫이 부착된 50mL 스크류 캡 튜브에 세포 현탁액을 여과합니다. 차가운 1x PBS로 모르타르와 유봉을 여러 번 세척하고 세포 현탁액을 수집하여 50mL 튜브에 추가합니다. 골수를 1,200 x g, 4°C에서 5분 동안 회전시킵니다. 유리 피펫이 부착된 진공 청소기를 통해 상층액을 제거합니다. 피펫을 사용하여 5mL의 1x PBS에 세포 펠릿을 현탁시킵니다.
4. 피펫을 사용하여 계면을 방해하지 않도록 세심한 주의를 기울여 실온 5mL(온도가 임계) 폴리수크로스의 상단에 부유골수를 천천히 추가합니다. 브레이크를 끈 상태에서 실온에서 400 x g으로 20분 동안 회전합니다.
5. 피펫으로 TMNC(Cloudy Total Mono-nuclear Cell) 계면을 수집하고 새 15mL 튜브에 넣습니다. 세척을 위해 1x PBS를 사용하여 부피를 최대 10mL까지 가져오고 계수를 위해 20μL를 취하고 1,200 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전합니다. 상등액을 버리고 4.6.1 단계를 위해 펠릿을 얼음 위에 보관하십시오.
6. c-Kit⁺ 세포 분리를 수행합니다.
   1. c-Kit⁺ 세포 분리를 위한 마이크로비드 키트 프로토콜을 따릅니다. 80μL의 1x PBS + EDTA + BSA에서 세포 펠렛을 10⁷ 세포에 재현탁합니다. 세포 현탁액에 20μL의 CD117 MicroBeads/10⁷ total cells를 추가합니다. 볼텍싱으로 잘 혼합하고 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 1x PBS + EDTA + BSA를 추가하여 부피를 최대 10mL까지 늘리고 1,200 x g에서 4°C에서 5분 동안 회전합니다.
   2. 진공을 통해 상층액을 제거하고 500 μL/10^{총 8}개 세포의 1x PBS + EDTA + BSA에 세포 펠렛을 현탁시킵니다. 마그네틱 컬럼이 부착된 마그넷 스탠드를 사용하여 3mL의 1x PBS + EDTA + BSA를 추가하고 중력을 통해 15mL 수집 튜브로 흐르도록 합니다.
   3. 첫 번째 완충액 추가가 컬럼 통과를 마치면 세포 현탁액을 컬럼에 추가하여 중력을 통해 15mL 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 이 플로우스루(flowthrough)는 바람직하지 않은 세포 분획입니다.
   4. 매번 3mL 1x PBS + EDTA + BSA로 컬럼을 3회 세척하여 중력을 통해 수집 튜브로 흐르도록 합니다. 자석에서 컬럼을 제거하고 15mL 튜브 상단에 놓습니다.
   5. 1x PBS + EDTA + BSA 5mL를 첨가하고 컬럼과 함께 제공된 플런저로 즉시 플러시합니다. 플런저를 제거하고 5mL의 1x PBS + EDTA + BSA를 추가로 주입하여 세척을 반복합니다. 표준 방법을 사용하여 전체 부피의 셀을 계산합니다.
   6. 1,200 x g에서 4°C에서 5분 동안 세포를 스핀다운합니다.상등액을 제거하고 펠릿을 완전한 IMDM(IMDM + 10% FBS + IL-6 [10ng/mL] + mSCF[50ng/mL] + FLT3 리간드[20ng/mL] + IL-3 [10ng/mL])으로 재현탁합니다. 이러한 세포를 37°C 및 5%_CO2의 인큐베이터에 넣어 2 x 10⁶ cells/1 mL cell IMDM complete media에서 하룻밤 동안 배양합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
생물학적 재료
국제경영시스템(IMDM	셀그로(corning)	15-016-CVR
재조합 쥐 SCF	프로스펙	CYT-275
재조합 쥐 Flt3-리간드	프로스펙	CYT-340
재조합 쥐 IL-6	프로스펙	CYT-350
재조합 쥐 IL-7	페프로텍	217-17
FBS(증권 시세	애틀랜타 생물학	S11150
PBS (PBS)	코 닝	21040CV
70 μm 나일론 셀 stariner	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	352350
LS 컬럼	밀테니	Tel.: 130-042-401
에디타	앰비언	AM9261
증권 시세	시그마	A7906
박격포 유봉	쿠어 텍	60316 및 60317
CD117 마이크로비드 키트	밀테니	Tel.: 130-091-224
자석 스탠드	밀테니

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