레트로바이러스 매개 형질도입: 암세포에 표적 유전자를 도입하는 방법

초록

출처: Kesarwani, M., et al. 종양유전자 의존성에서 c-fos 및 dusp1의 역할을 평가하는 방법. J. Vis. 특급 (2019).

이 동영상은 만성 골수성 백혈병 세포주에서 레트로바이러스를 사용하여 표적 유전자를 전달하여 유전자 검증을 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 레트로바이러스는 형질도입(transduction)이라는 과정을 통해 유전 물질을 백혈병 세포로 전달하는 매개체 역할을 하며, 이를 통해 표적 유전자의 장기 발현을 가능하게 합니다. 이 방법은 유전자 검증 및 치료제 개발을 위해 모든 표적 세포에 적용할 수 있습니다.

프로토콜

1. 변환

1. 레트로바이러스 플라스미드 형질주입(Retroviral plasmid transfection)
   1. HEK293 세포를 37°C로 설정된 수조에서 전날 오후에 갓 해동합니다. HEK 세포가 들어 있는 냉동 튜브를 실온에서 435 x g으로 3분 동안 돌립니다. 진공 청소기를 통해 상층액을 제거하고 10% FBS, 페니실린, 스트렙토마이신 및 글루타민이 보충된 1mL의 DMEM에 세포 펠렛을 현탁합니다.
   2. 세포를 세고 10cm 처리된 접시(~4 x 10,⁶ HEK293T 세포)에 적절한 부피를 추가합니다. DMEM 10 배지 14mL를 접시에 넣고 위아래로 밀어 균일하게 분포되도록 잘 혼합합니다. 접시를 37 ° C, 5 % CO₂ 인큐베이터에 밤새 놓습니다.
   3. 다음 날 아침, 도립 광 현미경으로 세포의 합류 지점을 확인합니다(50% 이상이 잘 작동함).
   4. 마이크로피펫을 사용하여 1.5 mL 튜브(= 500 μL)에 DNA(원하는 레트로바이러스 플라스미드), PclEco(패키징 플라스미드), 2 M CaCl₂ 및 H₂0을 7.5 μg의 DNA(BCR-ABL1-YFP), 7.5 μg의 pCLeco, 62 μL의 2 M CaCl₂ 및 물을 최종 부피 500 μL에 결합합니다. 500 μL의 2x HBS를 다른 1.5 mL 튜브에 추가합니다.
   5. 혼합하는 동안 500μL의 2x HBS(280mM NaCl, 100mM HEPES 및 1.5mM Na₂HPO₄)가 들어 있는 1.5mL 튜브에 DNA 혼합물을 적가합니다. 이를 위해 와류를 가장 낮은 속도로 설정하고 HBS 튜브를 그 위에 고정하여 transfection mix를 추가하는 동안 일정한 mixing을 수행합니다.
   6. 트랜스펙션 믹스를 실온에서 20-30분 동안 배양합니다. 배양 중에 HEK 세포에 25nM 클로로퀸을 첨가하고 다시 인큐베이터에 넣습니다. 배양 후, HEK 세포에 형질주입 혼합물을 적가형으로 첨가한 다음, 배지를 부드럽게 소용돌이치면서 플레이트 전체에 형질주입 혼합물을 혼합합니다.
   7. 37 ° C, 5 % CO₂ 인큐베이터에서 ~ 8 시간 동안 혼합물로 세포를 배양합니다. 14mL의 새로운 DMEM 10 배지를 매우 천천히 첨가하여 이러한 세포의 배지를 변경합니다. 접시 벽에 천천히 피펫을 대면 HEK 세포가 벗겨지는 것을 방지하는 데 도움이 됩니다. 37°C, 5% CO₂ 인큐베이터에서 밤새 세포를 배양합니다.
   8. 10mL 주사기로 바이러스 상등액을 채취하여 상층액을 주사기에 주입한 후 0.45μm 주사기 필터를 부착합니다. 바이러스 상층액을 새 수집 튜브에 넣습니다. ~16시간 후에 바이러스 상등액의 첫 번째 수집을 취하십시오.
2. Fibronectin 바이러스 농도 및 transduction
   1. 1x PBS에 있는 0.1mg 재조합 인간 피브로넥틴 단편 2mL를 처리되지 않은 6-well 배양 플레이트에 추가합니다. 세포와 유전자형의 수에 따라 필요한 만큼 피브로넥틴을 준비합니다. 하나의 웰로 1,000만 개의 c-Kit+ 세포를 충분히 transduction할 수 있습니다. 플레이트를 4 ° C에서 밤새 배양하십시오.
   2. 다음 날, 피펫으로 웰에서 피브로넥틴을 제거하고 1x PBS에 멸균 2% BSA 2mL를 피펫팅하여 플레이트를 막고 실온에서 30분 동안 배양합니다. 진공 청소기를 통해 BSA를 제거하고 1x PBS 2mL를 피펫팅하여 철저히 세척한 다음 진공 청소기를 통해 제거합니다.
   3. 새로 수집 및 여과된 (0.45 μm에서) 바이러스 상등액을 최대 5 mL까지 즉시 첨가합니다. 435 x g, 32°C에서 2시간 동안 원심분리기. 진공 청소기를 통해 상층액을 제거하고 새로 수집된 바이러스 상층액으로 이 단계를 반복하고 다시 돌립니다. 진공 청소기를 통해 상등액을 제거하고 2x PBS 1mL를 추가하여 웰을 세척합니다. 그런 다음 진공 청소기를 통해 제거하십시오.
   4. 세포를 회전시켜 하룻밤 동안 배양한 c-Kit+ 마우스 세포를 완전한 IMDM에 펠릿을 재현탁시켜 배양합니다. 세포 현탁액을 잘 혼합하고 현재 바이러스가 농축된 피브로넥틴 플레이트에 피펫으로 주입하여 37°C 및 5% CO₂)의 인큐베이터에 넣어 2 x 10⁶ cells/1 mL cell IMDM complete media에서 하룻밤 동안 배양합니다. 1,200 x g에서 25°C에서 90분 동안 회전합니다. 세포를 37°C, 5% CO2 인큐베이터에 넣습니다.
   5. 형질도입 후 48시간 후, 4°C에서 1,200 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 펠렛화하고 FACS 버퍼 #1(1x PBS + 0.5% BSA)에서 6 x 10⁶/mL로 재현탁합니다. 유세포 분석을 사용하여 YFP 양성 세포의 비율을 측정하여 BCR-ABL1 양성 세포의 비율을 측정합니다.
   6. 표준 절차에 따라 이벤트를 획득합니다. 먼저, 전방 및 측면 산란을 기준으로 살아있는 세포를 게이트합니다. 그런 다음 음성 대조군에 의해 결정된 YFP 음성 세포를 제외한 YFP 양성 라이브 셀을 게이트합니다(그림 1).

결과

그림 1: 이식된 마우스와 WT 마우스의 혈액에서 YFP+ 세포의 빈도를 보여주는 FACS(음성 대조군). 위쪽 패널에는 셀과 게이팅의 산점도가 표시됩니다. 아래쪽 패널은 YFP 대 측면 산란의 히스토그램을 보여줍니다. MFI가 >10³인 세포는 YFP+로 간주되었습니다. 형질도입 비율을 계산하기 위해 형질도입 후 골수 세포에 대해서도 유사한 게이팅이 사용되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
DMEM을 참조하십시오.	셀그로(corning)	15-013-CV
RetroNectin 재조합 인간 피브로넥틴 단편	다카라	T100B
FBS(증권 시세	애틀랜타 생물학	S11150
펜/스트렙	셀그로(corning)	30-002-CI
L-글루타민	셀그로(corning)	제25-005-CL	물에 5mg/mL 스톡
헤페스	시그마	H7006
PBS (PBS)	코 닝	21040CV
나2HPO4.7H2O	시그마	S9390
염화칼슘	인비트로젠	K278001
HBS 2개	인비트로젠	K278002
에디타	앰비언	AM9261
증권 시세	시그마	A7906
Human Long-Term Culture Initiating Cell Assay(인간 장기 배양 시작 세포 분석)	Stemp Cell 기술
TC-10 자동 세포 계수기	바이오 RAD
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/-	집에서 만든
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl	집에서 만든
로사크리어트2	잭슨 연구소
C57BL/6	잭슨 연구소
CML-CD34+ 및 일반 CD34+ 셀	신시내티 대학교 대학 병원
LSR II(FACS 분석기)	BD (영어)
Fortessa I(FACS 분석기)	BD (영어)
FACSAriaII(FACS 분류기)	BD (영어)
NAPCO 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터	써모 사이언티픽
스윙 버킷 로터 cetrifuge 5810R	에펜도르프
1/2 cc Lo-Dose u-100 인슐린 주사기 28 G1/2	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)	벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)
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0.45μM 아크로 디스크 필터	폴	2016-10

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