방법 논문

메틸 셀룰로오스 기반 CFU 분석: 백혈병 세포의 집락 형성에 대한 항암 화합물의 효과를 확인하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Kesarwani, M., et al. 종양유전자 의존성에서 c-fos 및 dusp1의 역할을 평가하는 방법. J. Vis. 특급 (2019).

이 비디오는 항암 화합물 치료에 대한 반응으로 백혈병 세포에 의해 형성된 집락의 수를 식별하고 계산하는 데 도움이 되는 메틸 셀룰로오스 기반 집락 형성 단위 또는 CFU 분석에 대한 프로토콜에 대해 설명합니다.

프로토콜

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1. 콜로니 형성 단위 분석

  1. 메틸셀룰로오스를 실온에서 1-2시간 동안 마우스용 사이토카인으로 해동합니다.바늘 없이 5mL 주사기를 사용하여 FACS 튜브에 메틸셀룰로오스 3mL를 분취합니다. 세포 분류기에서 YFP 양성 세포를 분류합니다.
  2. 세포를 스핀다운하고 IMDM complete media에서 펠릿을 현탁시킵니다. 도선할 세포를 세고 희석하여 100μL의 IMDM 완전 배지에서 5,000개의 YFP 양성 세포를 얻습니다.
  3. 5,000개의 YFP 양성 세포와 적절한 억제제를 함유한 세포 현탁액 100μL를 3mL의 메틸셀룰로오스에 첨가합니다. 10-30초 동안 혼합하기 위해 높은 곳에서 소용돌이를
    4. 일으킵니다.
  4. 대부분의 기포가 빠져나간 후 1mL 주사기를 사용하여 한쪽에서 매체를 배출하고 플레이트를 원을 그리며 천천히 기울여 고르게 펴서 3개의 복제 3cm 플레이트에 1mL의 매체를 플레이트합니다.
  5. 사용할 억제제의 최종 농도는 3μM의 이마티닙, 0.2μM의 DFC, 0.5μM의 BCI입니다. 적절한 경우 메틸셀룰로오스에 4-하이드록시타모시펜(1μg/mL)을 첨가하여 세포를 도금하여 c-Fos를 삭제합니다.
  6. 도금 후 중간에 2mL의 멸균수가 들어 있는 열린 접시 하나가 있는 큰 페트리 접시에 플레이트를 넣습니다. 큰 페트리 접시를 덮고 37 ° C, 5 % CO2 인큐베이터에서 조심스럽게 배양합니다. 도금 일주일 후 현미경으로 총 군체 수를 세어 군집 수를 기록하십시오.
  7. PCR에 의한 c-Fos 삭제를 위해 적절한 플레이트에서 몇 개의 콜로니를 분석합니다. P1000 팁으로 식민지를 빨아서 수집하십시오. PBS의 팁을 여러 번 세척하여 500μL의 1x PBS에서 세포를 제거합니다. 6,000 x g에서 1분 동안 세포 현탁액을 회전시키고 게놈 DNA 분리 키트를 사용하여 세포 펠릿에서 DNA를 추출합니다.
  8. 프라이머 mFos-FP3 및 mFos-RP5를 사용하여 PCR에 게놈 DNA를 사용합니다. 겔 문서화 시스템을 사용하여 2% 아가로스 겔 및 이미지에서 PCR 산물을 분석합니다.
  9. 군체를 그래픽으로 표현하려면 Iodonitrotetrazolium chloride를 사용하여 군체를 염색하십시오. 물 10mL에 Iodonitrotetrazolium chloride 10mg을 용해시켜 1mg/mL 용액을 얻습니다. 필터는 조직 배양 후드의 멸균 조건에서 10mL 주사기에 부착된 0.2μm 필터가 있는 Luer lock을 사용하여 용액을 멸균합니다.
  10. 조직 배양 후드에서 CFU 플레이트 주위에 100μL의 염색 용액을 적발합니다. 콜로니가 미끄러지거나 방해가 되지 않도록 주의하십시오. 37°C, 5% CO2 세포 배양 인큐베이터에서 플레이트를 밤새 배양합니다. 군체는 짙은 적갈색으로 변합니다. 멸균 조직 배양 후드의 흰색 배경을 사용하여 염색된 CFU 플레이트의 사진을 촬영합니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
국제경영시스템(IMDM셀그로(corning)15-016-CVR
MethoCult GF M3434 (마우스 CFU용 메틸셀룰로오스)줄기세포3434
4-하이드록시타목시펜시그마H6278
재조합 쥐 SCF프로스펙CYT-275
재조합 쥐 Flt3-리간드프로스펙CYT-340
재조합 쥐 IL-6프로스펙CYT-350
재조합 쥐 IL-7페프로텍217-17
증권 시세LKT 연구소 Inc.D3420
비씨아이켐존 사이언티픽뉴질랜드-06-195
이마티닙LC 연구자나-5508
PBS 1개셀그로(corning)21-040-이력서
1/2 cc Lo-Dose u-100 인슐린 주사기 28 G1/2벡턴 디킨슨(Becton Dickinson)329461
요오도니트로테트라졸륨 클로라이드시그마I10406
악기
NAPCO 시리즈 8000 WJ CO2 인큐베이터써모 사이언티픽
스윙 버킷 로터 cetrifuge 5810R에펜도르프
C-1000 열 순환기바이오 RAD
ChemiDoc Imaging System(겔 및 웨스턴 블롯용 이미징 시스템)바이오 RAD17001401
마우스
로사크리어트2잭슨 연구소
ROSACreERT2/c-Fos fl/fl Dusp1-/집에서 만든
ROSACreERT2/c-Fosfl/fl집에서 만든
) 년 년 표시기

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태그

CFU

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