음성 면역자기 선택: 말초 혈액 단핵 세포에서 B 세포를 정제하는 방법

Abstract

출처: Serra S. et al. 인간 만성 림프구성 백혈병 세포에서 세포외 뉴클레오티드/뉴클레오시드 대사를 모니터링하기 위한 HPLC 기반 분석. J. Vis. 특급 (2016)

이 비디오는 면역자기 표적화 및 말초 혈액 단핵 세포 현탁액에서 분리하여 B 세포를 정제하는 방법을 설명합니다. 이 방법은 특정 세포 표면 단백질을 표적으로 하는 특정 항체 또는 리간드(자성 입자에 연결됨)로 원치 않는 세포 유형을 라벨링하여 자기 분리에 의해 이종 세포 현탁액에서 고갈시키는 것을 포함합니다.

Protocol

1. 음성 분리에 의한 백혈병 B 세포 정제

1. PBS 0.1 % 소 혈청 알부민(BSA) 2 mM EDTA, pH 7.4(분리 완충액)에서 10⁷ PBMC/ml를 재현탁합니다.
2. 10⁷ 세포에 대해 10 μg의 마우스 단클론 항-CD3, -CD14 및 -CD16 1차 항체를 추가하고 4 °C에서 30분 동안 배양합니다.
3. 분리 완충액과 원심분리기로 세포를 500 x g에서 4°C에서 5분 동안 세척합니다.
4. 분리 버퍼의 세포를 10⁷ PBMC/ml로 재현탁합니다.
5. 세포와 함께 배양하기 전에 양 마우스 방지 IgG 마그네틱 비드를 바이알에 재현탁합니다. 10⁷ 세포당 100μl의 비드를 튜브로 이동합니다.
6. 1mL의 분리 버퍼를 추가하고 튜브를 자석 홀더에 1분 동안 넣습니다. 5ml 피펫으로 상등액을 버립니다.
7. 자석에서 튜브를 제거하고 세척된 비드를 100μl의 분리 버퍼에 다시 현탁합니다.
8. 10⁷ 세포를 100 μl의 마그네틱 비드로 4 °C에서 30 분 동안 부드럽게 기울이고 회전하여 배양합니다.
9. 튜브를 자석 홀더에 2분 동안 놓고 CD19⁺/CD5⁺ 결합되지 않은 세포가 있는 상등액을 5ml 피펫을 사용하여 새 튜브로 옮깁니다.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
인간의 피
정제된 항-CD3, -CD14, -CD16	자체 제작		마우스 단클론
Dynabeads 양 안티 마우스 IgG	인비트로젠	11031
인산염 완충 식염수(PBS)	암레스코	E404-200탭	정제
소 혈청 알부민(BSA)	아이디 바이오	1000-70	표준 등급
절연 버퍼			PBS 0.1% BSA 2mM EDTA, 산도 7.4
DynaMag-15 자석	인비트로젠	12301디	Dynal 마그네틱 비드 세퍼레이터