방법 논문

형광 표지된 T-ALL 세포 분리: 성체 제브라피시에서 T-ALL 세포를 분리하는 방법

2023년 4월 30일

이 논문에서

초록

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출처: Pruitt, M. M., et al. 제브라피시에서 Myc-induced T-cell Acute Lymphoblastic Leukemia in the Side Population. J. Vis. 특급 (2017).

이 프로토콜은 성체 제브라피시에서 형광 표지된 T 세포 급성 림프구 백혈병(T-ALL) 종양 세포를 분리하고 트리판 블루 염료를 사용하여 정량화하는 기술을 설명합니다.

프로토콜

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1. 원발성 종양 어류에서 형광 표지된 T-ALL 세포 수집

  1. 0.9x 인산염 완충 식염수(FBS/PBS)에 최소 20mL의 10% 열 비활성화 소 태아 혈청을 준비합니다.
  2. 헤파린 나트륨염 1바이알(300단위)에 FBS/PBS 1mL를 첨가합니다.
  3. 신체의 50% 이상에 종양이 있는 물고기 또는 먹거나 수영하는 데 어려움이 있는 물고기를 선택하십시오. 물고기에 트리카인을 과다 투여하거나 얼음물을 담가 물고기를 희생하십시오. 아가미 움직임과 심장 박동이 부족하여 사망을 확인합니다.
  4. 면도날을 사용하여 물고기의 머리를 제거하십시오.
  5. 헤파린 용액으로 물고기의 구멍을 씻어 과도한 적혈구를 제거하십시오.
    1. 피펫을 사용하여 100μL의 헤파린 용액(헤파린 나트륨 염 1바이알에 FBS/PBS 1mL 추가)을 물고기의 체강에 주입합니다. 쏟아져 나오는 모든 액체(혈액 세포가 포함됨)를 제거하고 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 피펫으로 넣습니다.
    2. 새 피펫 팁을 사용하여 몸을 다시 씻으십시오. 적어도 세 번 씻거나 쏟아져 나오는 액체에 피가 묻지 않을 때까지
      3. 씻으십시오.
    3. 이 단계에서 세척된 모든 액체는 추가 분석에 사용되지 않으므로 폐기하십시오.
  6. 백혈병 세포를 수집합니다.
    1. 100μL의 FBS/PBS를 물고기의 체강에 주입합니다.
    2. 피펫 팁으로 물고기의 몸 바깥쪽에 부드러운 압력을 가하여 종양 세포를 짜내거나 밀어냅니다.
      메모: 이 단계를 해부 현미경을 사용하여 수행하면 체강 밖으로 유출된 종양 세포를 확인할 수 있습니다.
    3. 각 세척제의 액체와 세포를 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 모읍니다.
    4. 대부분의 종양 세포가 수집될 때까지(보통 5-10회) 1.6.1-1.6.3 단계를 반복합니다. 모든 종양 세포를 동일한 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브에 수집합니다. 세포를 실온에 보관하십시오.
  7. 이전 단계에서 수집된 종양 세포를 부드럽게 피펫팅하여 세포 덩어리를 분리하여 혼합합니다. 40μm 메쉬 필터를 통해 셀 현탁액을 필터링합니다. 100μL의 FBS/PBS로 필터를 1-2회 세척합니다. 세포를 실온에 보관하십시오.
  8. 새 튜브에서 2μL의 세포 현탁액과 18μL의 트리판 블루(0.4%, 1:10으로 희석되어 여과됨)를 혼합합니다. 혈구계에 10 μL를 로드하고 살아있는(파란색이 아닌) 형광 세포의 수를 세어 분리된 종양 세포의 수를 계산합니다.
    메모: 파란색이 아닌 GFP 음성 세포는 정상적이고 악성이 아닌 T 세포일 가능성이 높으므로 계산해서는 안 됩니다. Hoechst 33342로 세포를 염색하려면 최소 2 x 106 개의 세포가 필요합니다.

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공개 사항

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
선언된 이해 상충이 없습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
생제닉 제브라피시(CG2)Mizgireuv et al., 2006 참조
RAG2:C-MyC 플라스미드랑게나우 연구소
rag2:de Jong Lab에서 제작된 GFP 플라스미드Langenau Laboratory의 rag2 프로모터
pCS2-트랜스포사제 플라스미드치엔 연구소
SteREO Discovery V8 현미경Carl Zeiss 현미경 검사제495015-0008-000
트리카인 메탄설포네이트(MS-222)웨스턴 케미컬, Inc피셔 사이언티픽 - NC0342409100 지
소 태아 혈청(FBS)하이클론 연구소, Inc.피셔 사이언티픽 - SH3007103500 밀리리터
인산염 완충 식염수(PBS)Life Technologies의 Gibco1001-023pH 7.4 (1x) - 500 mL
헤파린 나트륨 염시그마-알드리치210615 - 300 유닛 바이알
40μm 메쉬 필터팔콘코닝 브랜드35234050 케이스
트리판 블루시그마 생명과학T815420 mL - 용액 (0.4%)
호 년 년

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태그

FBS PBSGFP

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